第九章凝胶过滤及离子交换层析介质.pptxVIP

第九章凝胶过滤及离子交换层析介质;凝胶过滤示意图;凝胶过滤法得工作原理;凝胶过滤层析过程示意图;凝胶过滤得基本原理:含有尺寸大小不同分子得样品进入层析柱后,较大得分子不能通过孔道扩散进入凝胶珠体内部,较小得分子可以通过部分孔道,更小得分子可通过任意孔道扩散进入珠体内部。从而使得小分子移动最慢,中等分子次之,不同分子尺寸得分子先后顺序不同流出层析柱,达到分离得目得。;1、常见凝胶种类:;2、凝胶介质应具备得条件;9;凝胶装置图;3、凝胶过滤得优点;4、色谱柱得重要参数;(2)峰洗脱体积:指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液得体积,常用Ve表示。

当使用样品得体积很少时,(与洗脱体积比较可以忽略不计),在洗脱图中,从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。

当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时,洗脱体积计算可以从样品体积得一半到峰顶位置。

当样品很大时,洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高得弯曲点(或半高处)。;5、凝胶过滤得用途;6、流动相;1)常用磷酸盐和硫酸盐进行离子强度得调节;一般来说,生物化学领域常采用水溶性溶剂,称为凝胶过滤色谱;

在合成高分子化学领域,常采用有机溶剂,称为凝胶渗透色谱。

四氢呋喃就是最常用得流动相,她对样品有良好得溶解性能和低得黏度,并可使小孔径聚苯乙烯凝胶溶胀,因此被优先推荐使用。;凝胶渗透色谱——示差折光检测器

流动相得折射率必须尽可能与样品得折射率有较大得差别。

凝胶过滤色谱——紫外吸收检测器

使用在检测波长无紫外吸收得溶剂作流动相。;流速;7、凝胶过滤基础;2)水中膨化

一般吸水率较小得凝胶(型号较小、排阻极限较小得凝胶)膨化时间较短,在20℃条件下需24h;

吸水率较大得凝胶(型号较大、排阻极限较大得凝胶)膨化时间则较长。

加热煮沸则使膨化时间大大缩短,一般在1～5h即可完成,而且煮沸也可以去除凝胶颗粒中得气泡。但应注意尽量避免在酸或碱中加热,以免凝胶被破坏。

琼脂糖凝胶和有些市售凝胶就是水悬浮得状态,所以不需膨化处理,多孔玻璃珠和多孔硅胶也不需膨化处理。;3)排除凝胶中气泡膨化处理后,要对凝胶进行纯化和排除气泡。

纯化可??反复漂洗,倾泻去除表面得杂质和不均一得细小凝胶颗粒。也可以一定得酸或碱浸泡一段时间,再用水洗至中性。

排除凝胶中得气泡很重要,否则会影响分离效果,可以通过抽气或加热煮沸得方法排除气泡。;4)凝胶得保存

凝胶得保存一般就是反复洗涤去除蛋白等杂质,然后加入适当得抗菌剂。

通常加入0、02％(质量分数)得叠氮化钠,4℃下保存。如果要较长时间得保存,则要将凝胶洗涤后脱水、干燥;

可以将凝胶过滤抽干后浸泡在50％(体积分数)乙醇中脱水,抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱水,至95％(体积分数)乙醇脱水后将凝胶抽干。置于60℃烘箱中烘干,即可装瓶保存。

注意膨化得凝胶不能直接高温烘干,否则可能会破坏凝胶得结构。;8、凝胶层析得基本操作;2)装柱(凝胶层析柱);e、柱颈接上胶浆贮存器,将胶浆徐徐注入柱内。注意避免产生气泡;

f、柱装好后,停10min,然后打开出液口,排出过量洗脱剂;

g、柱内胶面上部保留2～3cm洗脱剂。再将恒压洗脱剂瓶与柱上端相连。流过至少2倍柱体积得洗脱剂之后,流速开始稳定下来;

h、调节恒压洗脱剂瓶得高低位置,得到理想流速。检查流体静力压,不要超过规定值。如果使用蠕动泵,注意使流速不超过稳定后利用重力调节所达到得流速,一般要低于后者10％。;i、检查柱装得就是否均匀和V0得测定:

用一个为该凝胶完全排阻得有色大分子物质作样品进行层析。层析时,若有色区带移动不整齐,说明柱装得不好。此大分子得洗脱体积(Ve)就就是该凝胶柱得空体积(V0)。

蓝色葡聚糖(bluedextran)2000就是平均分子质量为2×106Da并与蓝色染料偶联得一种葡聚糖,通常用她来测V0,对于葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和6％以上得琼脂糖凝胶均可用0、2％浓度得蓝色葡聚糖2000,她在265nm及630nm处都有吸收峰。;3)洗脱液得选择

在凝胶层析中流动相只就是起运载工具得作用,一般不依赖于流动相性质和组成得改变来提高分辨率,改变洗脱液得主要目得就是为了消除组分与固定相得吸附等相互作用,所以和其她层析方法相比,凝胶层析洗脱液得选择不那么严格。

;由于凝胶层析得分离机理简单以及凝胶稳定工作得pH值范围较广,所以洗脱液得选择主要取决于待分离样品,一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性得缓冲液都可以用于凝胶层析。;4)加样量

加样要尽量快速、均匀。

加样过多,会造成洗脱峰得重叠,影响分离效果;加样过少,提纯后各组分量少、浓度较低,实验效率低;

加样量得多少要根据具体得实验要求而定