岩藻糖基乳糖合成关键酶分子改造及自组装.pdfVIP

摘要

岩藻糖基乳糖作为人乳寡糖中的重要组成成分，具有改善肠道菌群缓解肠道疾病、

增强免疫减轻过敏反应、促进大脑发育提升认知能力等多种生理学功能，在食品和医

疗保健等领域已广泛应用，特别是作为婴幼儿配方奶粉的添加成分，其市场需求正在

一步步提升。由GDP-D-甘露糖生成GDP-L-岩藻糖的过程是岩藻糖基乳糖合成途径中

的重要步骤，但限于GDP-L-岩藻糖合成酶酶活性较低，造成GDP-L-岩藻糖积累量较

少，限制了岩藻糖基乳糖的合成。因此本研究以岩藻糖基乳糖生物合成途径中的关键

酶GDP-L-岩藻糖合成酶为研究对象，结合生物信息学及结构生物学相关知识，对关键

酶进行理性/半理性分析，采用定点突变、饱和突变方式分子改造，提高关键酶的酶活

性，并构建多酶级联体系，提升催化速率，为岩藻糖基乳糖的生物合成提供更加高效

的酶元件。

首先，利用E.coliBL21(DE3)对GDP-L-岩藻糖合成酶进行表达，分析表征该酶的

酶学性质，结果表明，在30℃、pH7.5反应条件下，其比酶活为1.53U/mg，为非金

属离子依赖型酶，在30℃条件下保温48h，活性仍能残留60%。

其次，对GDP-L-岩藻糖合成酶进行理性/半理性分子改造提高其催化活性。选择

底物GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖和辅因子NADPH周围的氨基酸残基，利用RossetaddG

软件计算筛选氨基酸虚拟突变自由能的变化，选择自由能相比于野生型降低的位点作

为候选。共选择31个突变位点进行实验表征测试，获得多个活性提升的单点突变体。

进一步开展优势突变体组合，获得突变体M3。在此基础上，基于序列一致性分析、

底物通道工程、关键Loop区域解析等多种策略，获得突变体M4，其活性相比野生型

提升3.25倍。

最后，基于SpyTag/SpyCatcher氨基酸残基之间的共价酰胺键相互作用，分别在

GDP-甘露糖4,6-脱水酶和GDP-L-岩藻糖合成酶的N、C端融合表达了

SpyTag/SpyCatcher，构建了体外多酶自组装体系。研究发现，组装标签SpyTag-

SpyCatcher可以成功介导GDP-甘露糖4,6-脱水酶和GDP-L-岩藻糖合成酶在体外进行

自组装，且实现组装酶级联催化效率是同浓度游离酶的1.46倍。为高效转化GDP-D-

甘露糖合成GDP-L-岩藻糖提供基础。

关键词：岩藻糖基乳糖；GDP-L-岩藻糖合成酶；分子改造；自组装体系

ABSTRACT

Asanimportantcomponentofhumanmilkoligosaccharides,fucosyllactosehasvarious

physiologicalfunctionssuchasimprovingintestinalfloraandalleviatingintestinaldiseases,

enhancingimmunityandalleviatingallergicreactions,promotingbraindevelopment,and

improvingcognitiveability.Itiswidelyusedinfoodandmedicaltreatments.Ithasbeen

widelyusedinhealthcareandotherfields,especiallyasanadditivetoinfantformula,and

itsmarketdemandisincreasingstepbystep.TheprocessofgeneratingGDP-L-fucosefrom

GDP-D-mannoseisanimportantstepinthefucosyllactosesynthesispathway,butitislimited

bythelowenzymeactivityofGDP-L-fucosesynthase,resultinginGDP-L-Theaccumulation

offucoseislow,limitingthesynthesisoffucosyll