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结核分枝杆菌耐药监测指南（2025年版）

结核分枝杆菌耐药监测是结核病防控体系的核心组成部分，通过系统性收集、分析和反馈耐药信息，可为临床诊疗、公共卫生决策及科研提供关键数据支撑。本指南聚焦2025年及未来一段时期我国结核分枝杆菌耐药监测工作的规范化实施，围绕监测范围、技术方法、质量控制、数据管理与应用等核心环节，提出具体操作要求与优化策略。

一、监测范围与对象

监测覆盖全国31个省（自治区、直辖市）及新疆生产建设兵团，以地级市为基本监测单元，优先强化结核病高负担地区（年报告肺结核患者数≥5000例的地市）、耐药高发地区（耐多药肺结核报告率≥5%的地市）及边境地区的监测密度。监测对象分为三类：

1.目标患者群体：所有新登记且未接受过抗结核治疗的肺结核患者（新发病例），占监测总量的70%；治疗失败、复发或中断治疗后重新登记的肺结核患者（复治病例），占监测总量的25%；耐多药/广泛耐药肺结核患者的密切接触者（定义为与患者同室居住≥1个月的家庭成员或医护人员），占监测总量的5%。

2.样本类型：以痰标本为主，包括晨痰（首次咳出）、夜间痰（睡前咳出）和即时痰（就诊时咳出），要求每份样本量≥5ml且呈脓性或黏液性；无法获取痰标本的患者（如儿童、无痰患者）可采集支气管肺泡灌洗液或胃洗液，需在采集后2小时内冷藏（4℃）保存。

3.时间跨度：监测为连续性年度监测，单轮监测周期为12个月（1月1日至12月31日），确保数据的时间序列完整性。

二、实验室检测技术规范

实验室检测是耐药监测的技术核心，需严格遵循标准化流程，兼顾准确性与时效性。检测项目包括一线抗结核药物（异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺）和二线抗结核药物（氟喹诺酮类、注射类药物、贝达喹啉等）的耐药性检测。

（一）样本处理与前处理

痰标本需经4%NaOH-N-乙酰-L-半胱氨酸（NALC）消化处理，离心后取沉淀接种培养基。消化时间控制在15-20分钟，避免过度处理导致活菌死亡。消化后标本需用磷酸盐缓冲液（PBS）中和至pH6.8-7.2，离心（3000g，15分钟）后弃上清，沉淀用于接种或核酸提取。

（二）表型耐药检测

表型检测以比例法为金标准，适用于所有目标样本。培养基选择Middlebrook7H10（固体）或MGIT960（液体），需根据药物特性调整培养基含药浓度：

-异烟肼（INH）：固体培养基含药浓度0.1μg/ml（低浓度）和1.0μg/ml（高浓度），液体培养基0.1μg/ml；

-利福平（RFP）：固体培养基含药浓度1.0μg/ml，液体培养基1.0μg/ml；

-乙胺丁醇（EMB）：固体培养基5.0μg/ml，液体培养基5.0μg/ml；

-吡嗪酰胺（PZA）：需使用酸性培养基（pH5.5），含药浓度100μg/ml。

培养条件为37℃、5%CO?环境，固体培养基观察8周，液体培养基通过荧光检测实时监测生长情况（最长42天）。结果判读时，耐药定义为含药培养基菌落数≥不含药培养基菌落数的1%（比例法）或液体培养基生长指数≥阈值（MGIT960）。

（三）分子耐药检测

分子检测作为表型检测的补充，重点用于快速筛查利福平（RIF）和异烟肼（INH）耐药（一线药物）及氟喹诺酮类（如左氧氟沙星）耐药（二线药物）。推荐使用XpertMTB/RIFUltra（第五代）进行初始筛查，检测靶标为rpoB基因（利福平耐药相关）和katG/inhA基因（异烟肼耐药相关）。全基因组测序（WGS）用于疑难耐药株的精准分析，覆盖所有已知耐药相关基因（如rpoB、katG、gyrA、gyrB等），测序深度≥30×，变异分析需使用国际公认数据库（如TBDReamDB）进行注释。

分子检测流程需严格控制交叉污染：提取核酸时使用带滤芯枪头，分区操作（试剂准备区、样本处理区、扩增区、产物分析区），每批次检测设置阴性（无模板）和阳性（已知耐药株）对照。结果解读需结合表型检测，若分子检测提示耐药但表型敏感，需重复检测或进行WGS验证。

三、质量控制体系

质量控制贯穿监测全流程，分为实验室内部质控（IQC）和外部质控（EQC），确保检测结果的准确性和可比性。

（一）实验室内部质控

1.菌株管理：每批次检测使用标准菌株（H37Rv为敏感株，H37Ra为阴性对照，WHO推荐的耐药标准株如R01（INH耐药）、R02（RIF耐药）等）进行阳性对照，确保培养基和试剂有效性。

2.操作规范：样本处理、接种、培养等环节需双人核对，关键步骤（如消化时间、离心转速）需记录并定期抽查。液体培养仪（如MGIT960）每日校准光路系统，每周进行背景值检测。

3.结果复核：对初筛耐药的样本，需由另