洗涤用蛋白酶的筛选与高效表达.pdfVIP

摘要

uppeps

本论文从实验室前期构建的缺失了反向筛选基因、胞外粘多糖合成基因簇

γ-pgs5-Fu

和聚谷氨酸合成基因簇，可以使用抗性作负筛选，发酵液不会产生粘性物

质的Bacilluslicheniformis2709(TCCC11210)菌株出发，首先借助基因组精简技术缺

失基因组中除AprE之外的胞外蛋白酶基因，其次通过基因组整合的方式表达了两个

胞外蛋白酶nprS-15615和AH-101，然后将含有这两个胞外蛋白酶基因的基因工程菌

株分别进行发酵，并对二者的酶学特性进行研究，最后将二者加入到洗涤系统中进行

洗涤应用实验研究，最终获得两个可以用于洗涤剂工业的胞外蛋白酶。具体研究内容

如下：

(1)胞外蛋白酶基因的缺失：首先通过全基因组测序和基因组功能注释确定TCCC

11210基因组内存在除AprE之外的三个胞外蛋白酶，即Epr、Bpr和Vpr，从

TCCC11210出发依次敲除此3个基因区域，构建菌株BLΔEpr、BLΔEprΔBpr和

BLΔEprΔBprΔVpr，分别删除基因1539bp、5533bp和1546bp，以Bacilluslicheniformis

2709BLΔEprBLΔEprΔBprBLΔEprΔBprΔVprLB

为对照菌株，对比了、和在基础培

养基中的生长情况，研究结果表明与对照菌株相比，各基因缺失菌株的生长速率未出

现明显变化，且遗传性状稳定。

(2)外源基因的整合：通过本课题组前期筛选出的表达元件和表达位点，使用AprE

的启动子和信号肽通过同源重组的方式在AprE位点完成外源基因的替换表达。其中

胞外蛋白酶nprS-15615是从本课题组原保存的Planococcussp.11815菌株中获得，胞

外蛋白酶AH-101是通过NCBI数据库进行筛选获得。整合完成后对两个基因工程菌

5.37.8

株进行发酵研究，结果表明两株菌的发酵酶活力较原菌株分别提高了倍和倍。

(3)重组胞外蛋白酶特性研究：将整合完毕后的菌株进行发酵，随后进行酶学特性研

究。结果发现重组胞外蛋白酶nprS-15615的最适作用温度为30℃；最适作用pH值

2+2+2+

为8.0；Mg、Ca和Mn对重组胞外蛋白酶nprS-15615的活性具有增强作用，金

属离子螯合剂EDTA对重组胞外蛋白酶的活性有明显抑制作用。重组胞外蛋白酶

AH-10160℃pH11.0Mg2+Ca2+

在时活性最高，最适作用值为；、对重组胞外蛋白酶

AH-101活力有一定的促进作用，PMSF会强烈抑制重组胞外蛋白酶AH-101活性。

(4)重组胞外蛋白酶洗涤应用研究：在进行洗涤实验之前，首先进行表面活性剂和液

体洗涤剂对重组胞外蛋白酶活性影响的研究，结果表明，表面活性剂和液体洗涤剂对

重组胞外蛋白酶nprS-15615和重组胞外蛋白酶AH-101的活性影响均较小。将重组胞

外蛋白酶添加到洗涤系统中进行洗涤效果的测定，结果表明，将两种重组胞外蛋白酶

加入到洗涤系统中以后，蛋白污布的白度值与对照相比均有提高，说明两种胞外蛋白

酶都可以提高洗涤效果，可以作为环保型添加剂应用到洗涤工业当中。

总之，本研究成功构建了一株可用于外源蛋白酶表达的基因工程菌株，并成功筛

选到两个胞外蛋白酶基因，在宿主基因组中完成了整合表达并对其酶学性质和洗涤效

果进行了研究，结果表明这两个胞外蛋白酶均可以增强洗涤效果，为洗涤剂工业提供

了环保型酶制剂。

关键词：地衣芽孢杆菌基因组整合酶学特性洗涤工业;;;