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基因编辑与生物安全手册（执行版）

第一章基因编辑技术概述

1.1常用基因编辑工具原理

CRISPR-Cas9系统利用向导RNA（gRNA）引导Cas9核酸酶在基因组特定位点产生双链断裂（DSB），随后通过非同源末端连接（NHEJ）导致插入或缺失突变（Indel），从而敲除或修改基因序列。该机制的核心在于gRNA通过碱基互补配对识别目标DNA序列，Cas9蛋白随后在断裂位点附近3端进行切割，其切割效率与gRNA与目标序列的匹配度呈指数级关系。锌指核酸酶（ZFN）由人工设计的锌指蛋白模块与Cas9蛋白融合而成，锌指模块通过识别特定的DNA碱基对进行定位，其特异性远高于CRISPR，但构建过程繁琐且成本高昂，通常需要设计多个独立的锌指片段来覆盖长距离的靶序列。

碱基编辑（BaseEditing）技术通过引入脱氧核糖核酸酶（dNuc）或脱氧鸟苷核酸酶（dGNAc）而非双链断裂，直接将碱基从一种类型转换为另一种类型（如C转T或A转G），避免了NHEJ引起的插入缺失，从而实现了精准的碱基替换而不破坏基因结构完整性。先导编辑（PrimeEditing）利用逆转录酶或DNA聚合酶作为工程化载体，携带随机序列的“先导RNA进入细胞，在靶位点附近进行精确的碱基替换或微插入/微删除，其优势在于无需产生双链断裂，且编辑效率几乎不