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蛋白质免疫印迹操作规范

蛋白质免疫印迹操作规范

一（1）样品采集与预处理环节是蛋白质免疫印迹操作规范的根基，其核心目标是最大限度抑制蛋白酶降解、维持蛋白翻译后修饰原貌并保证后续定量可比性。细胞样本处理时，需先吸弃培养液，以预冷PBS漂洗贴壁细胞两到三次，彻底去除含血清培养基残留，随后按每百万细胞加入一百到二百微升含蛋白酶抑制剂cocktl及磷酸酶抑制剂的RIPA或NP-40裂解液，冰上静置裂解二十到三十分钟，期间用细胞刮轻柔收集或辅以低功率超声破碎核酸降低粘度，四摄氏度一万二千转离心十五分钟取上清；组织样本需液氮速冻后研钵磨粉或匀浆器破碎，脂肪与结缔组织预先剔除，每五十到一百毫克组织配一毫升裂解液，同样低温离心取上清。所有操作须置于冰盒或四摄氏度环境，蛋白酶抑制剂临用前加入，磷酸化蛋白检测时PMSF、Na3VO4、NaF缺一不可。样品分装避免反复冻融，标记清楚组别、浓度、处理时间与储存位置，构成可追溯的原始数据链。

一（2）蛋白浓度测定与上样体系归一化决定条带灰度比较是否成立。采用BCA法或Bradford法绘制标准曲线，BSA标准品梯度覆盖零到二克每升，每组样品取一至二微升重复测定两次取均值，计算总蛋白浓度后将各样品用裂解液稀释至统一浓度（如二毫克每毫升）。上样缓冲液按一比四或一比五加入五倍浓缩LoadingBuffer（含SDS、溴酚蓝、甘油、