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基因表达量qPCR（实时荧光定量PCR）完整检测步骤

常规采用SYBRGreen染料法（最常用于基因相对表达量检测）；若为TaqMan探针法，仅引物探针体系略有区别，流程大体一致。

核心目的：检测mRNA水平基因相对表达量，样本前期必须先做RNA提取→反转录得到cDNA。

一、实验前准备（关键，防污染）

耗材：无RNase/DNase的枪头、PCR八联管/96孔板、封板膜、离心管

试剂：RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、qPCR预混液（2×SYBRqPCRMix）、目的基因引物、内参基因引物（常用GAPDH、β-actin、18SrRNA等）、无酶水

仪器：高速冷冻离心机、Nanodrop/荧光定量仪测RNA浓度、PCR仪（反转录）、实时荧光定量PCR仪

分区操作：RNA提取区、配体系区、上样区、扩增检测区分开，避免气溶胶污染；全程戴手套口罩

二、第一步：总RNA提取与质控

组织/细胞样本裂解：细胞加Trizol，组织研磨后加Trizol，室温静置裂解

氯仿抽提、离心分层，吸取上层水相（含RNA）

异丙醇沉淀RNA，75%无酶乙醇洗涤沉淀，干燥后无酶水溶解RNA

RNA质控

浓度与纯度：Nanodrop测OD260/280（1.8~2.1合格），OD260/230＞2.0

琼脂糖电泳/毛细