2食品中蛋白质的测定.pptVIP

实验二 食品中蛋白质的测定 一、实验目的 1. 了解凯氏定氮法测定蛋白质的定义； 2. 学习掌握凯氏定氮法测定蛋白质的原理及操作方法。 二、基本原理 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。 1. 消化： Δ H2SO4 → SO2+ H2O+[O] O ‖ R- CH- COOH +[O] → R-C- COOH + NH3 ∣ NH2 O ‖ [O] R- C- COOH → nCO2 +mH2O 2NH3 +H2SO4 → (NH4)2SO4 2. 蒸馏： Δ (NH4)2SO4+2NaOH→Na2SO4+2H2O+2NH3↑ 3. 吸收：蒸馏出来的氨用硼酸吸收。 2NH3 + 4H3BO3 → (NH4)2B4O7 +5H2O 4. 滴定：吸收液用盐酸标准液滴定。 (NH4)2B4O7+ 2HCl + 5H2O → 2NH4Cl + 4H3BO3 三、实验器材 1. 试剂： （1）硫酸铜(CuSO4.5H2O)； （2）硫酸钾； （3）硫酸 (密度为1.8419 g/L)； （4）2%硼酸溶液； （5）40%氢氧化钠溶液； （6）0.05 mol/L盐酸标准滴定溶液； （7）混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%亚甲基蓝乙醇溶液临用时混合。 2. 仪器 （1）凯氏烧瓶（100 mL）； （2）小漏斗； （3）容量瓶（100 mL）； （４）接收瓶（小三角瓶）； （5）微量滴定管（2 mL或10 mL）； （6）凯氏定氮装置 四、操作步骤 1. 试样处理： 称取0.20g - 2. 00g固体试样或2. 00 g - 5. 00 g半固体试样或吸取10.00-25.00mL液体试样（约相当氮30mg-40mg），移人干燥的100mL或500mL定氮瓶中； 3. 定容：沿瓶壁加入少量蒸馏水稍加稀释，移入100Ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验； 4. 蒸馏：按图装好凯氏定氮装置1-2 于水蒸气发生瓶内装蒸馏水至三分之二处，加入数粒玻璃珠，加甲基红指示液数滴及数毫升盐酸标准液，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。 向接收瓶内加入10 mL硼酸溶液（2%）及1滴-2滴混合指示液，并使冷凝管的下端插人液面下，准确吸取10 mL试样处理液由小玻杯（进样口）流入反应室，并以10 mL水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧进样口。 将10mL 40%氢氧化钠溶液倒人小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。打开螺旋夹，开始蒸馏计时。蒸汽通入反应室使氨通过冷管而进入接受瓶内，蒸馏5 min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1 min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。 5. 滴定：取下接收瓶。以0.05mol/L盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点，记录所用酸液的毫升数（V1）。同时准确吸取10mL试剂空白消化液同上操作，记录所用酸液的毫升数（V2）； 6. 冲洗反应室：蒸馏完毕，由小玻杯中倒入适量的蒸馏水（待蒸气很足、反应室外壳温度很高时），一手轻提棒状玻塞使冷水流入反应室，同时立即用另一手旋紧螺旋夹，切断气源，使反应室内的废液自动吸出至外层中，如此反复洗三次后，打开螺旋夹，使废液排走，然后可进行下一样品的测定。 7. 计算结果： 试样中蛋白质的含量按下式进行计算 粗蛋白X（%）= 式中： X——试样中蛋白质的含量，单位为克每百克或克每百毫升(g/100g 或g/100mL)； V1——试样消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升mL； V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升mL； N ——硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，单位为摩尔每升(mol/L); 0.0140——每毫升盐酸标准液相当氮的质量，单位为克g； W ——试样的质量，单位为克g； F ——氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25。 五、注意事项 1. 消化要在通风厨内进行。烧瓶应洗净干燥，移入样品时防止粘在颈壁。消化瓶在电热架上最好成45°斜角； 2. 消化时