原位微量BCA蛋白定量法.docVIP

  1. 1、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。。
  2. 2、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载
  3. 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
  4. 4、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
  5. 5、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们
  6. 6、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
  7. 7、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
原位微量BCA蛋白定量法简述: 传统标准的BCA蛋白定量分析方法常规均使用试管或者微孔板进行检测,通过对传统方法进行改进,可使用BioTek公司的Take3TM 超微量多体积检测板进行原位微量BCA法蛋白定量分析。待测蛋白样品和BCA工作缓冲液按照顺序直接加在Take3TM板的微量定量孔处、 温浴,使用EpochTM 微孔板分光光度计进行检测。和传统标准BCA方法(BCA工作缓冲液和蛋白质样品体积比为20:1)相比,该方法的蛋白检测灵敏度有明显的提高。相比与 Mini-BCA分析方法,原位分析方法更加精确。 介绍 BCA法是十分常用的蛋白质比色定量方法,很多试剂供应商都提供基于比色皿和微孔板的BCA蛋白定量 试剂盒。BCA蛋白定量法相对于其它比色定量法具有操作简单、稳定、灵敏度高等优点。相对于蛋白质的固有的280nm吸收峰检测,BCA检测法提高了蛋白 检测灵敏度和特异性,消除了核酸的干扰,核酸干扰在对细胞裂解物或其他生物样品进行蛋白定量时总是一个难以避免的干扰。在碱性条件下,蛋白将Cu2+ 还原为Cu+ ,Cu+ 与BCA 试剂形成紫色络合物,如图1,其吸光值与蛋白浓度成正比。测定在562nm 处的吸收值,并与标准曲线对比,即可计算待测蛋白的浓度。 ? 图1. BCA法蛋白质定量。Cu(BCA)2耦合物在592nm有一很强的吸收值,7700L/mol/cm。 近几年开发的一些精密的检测仪器,都可以使用短光程、微量体积的样品进行比色定量,例如NanoDrop(ThermoFisher Scientific)。这个仪器内置了蛋白质280nm直接定量法,这种方法可以有效的避免浪费样品且操作简单。在直接蛋白定量的基础上,这些仪器还发 展了蛋白质比色定量法,例如BCA法。通过调整蛋白质和BCA工作缓冲液的相对体积比,由原来的20:1调整为1:1,这种微量定量方法转换校准曲线的工 作范围,使之更适合于微孔板或短光程检测,这种方法叫Mini-BCA法。然而对于这些通过把样品加在检测基座上的仪器来讲,蛋白质和BCA工作缓冲液必 须先在一个额外的试剂槽里进行混匀和温浴,然后才能滴加到检测基座上进行检测。这样会增加操作的复杂性,增加了样品的浪费。 这里我们介绍一下如何使用Take3 超微量多体积检测板进行原位微量BCA蛋白定量法。使用Take3 超微量多体积检测板进行Mini-BCA法检测操作步骤简单,整个流程和使用典型的96孔微孔板检测相似,直接把BCA工作缓冲液和样品滴加在Take3 板的微孔处,不需要先在其它容器混匀进行颜色反应。这样做的好处是可以提高操作的便捷性,每次检测只需要2ul样品,非常节约样品。 实验材料和方法检测试剂盒(Sigma-Aldrich公司)、小牛血清(BSA)(Sigma-Aldrich公司)。我们使用两种实验方法来进 行BCA检测。 第一种方法 按照NanoDrop技术手册推荐的“Mini-BCA”法。其简要流程是:BCA检测系统混合好的10ulBCA工作缓冲液和10ul的标准蛋白 或待测的10μl样品(1:1)在试管中混匀,37℃温浴30分钟后进行检测。 第二种方法 使用Take3超微量多体积检测板进行原位检测。其简要流程是:直接按照顺序滴加2ul标准蛋白或样品,然后再滴加2ul BCA工作缓冲液到Take3板的检测孔上,标准蛋白和检测样品每个2份,室温(22℃)孵育25分钟后进行样品的定量检测。 ? 如图图2. Take3 微量定量板上的16个检测孔的上下石英表面相当于原位BCA法反应和检测管路,加样完成后合上Take3板,室温放置25分钟后,使用Epoch微孔板分 光光度计检测。 小牛血清标准蛋白按照1:3或1:2 系列稀释成7个点,浓度范围分别在0.01-2mg/ml或0.01-3mg/ml。1:2系列稀释的样品用于比较两种方法的灵敏度。为了比较两种方法的 精确性,我们根据图3 制定了一个Take3板布局,使用6个点 1:3系列稀释的样品,浓度范围在0.01-1.0mg/ml。在Take3板上进行微量体积原位BCA分析,推荐使用下面的布局。 ? 空白对照是1:1体积的BCA工作缓冲液和去离子水。BCA法蛋白定量的检测波长为562nm.BSA的实际浓度是使用Take3和1cm标准光程 的BioCell石英比色杯在Epoch分光光度计上检测得到的。 结果讨论: 反应动力学典型的BCA法检测方案需要体积比为20:1的BCA缓冲液和蛋白样品,NanoDrop 技术手册使用的是4ul蛋白质样品加到80ulBCA缓冲液中。即使在标准曲线的高浓度端(例如: 2mg/ml BSA),BCA工作缓冲液的活性成分的摩尔量明显超过参与反应的蛋白质(见表1)。同样也超过双缩脲反应的结合位点(肽键,半胱氨酸,胱氨酸,色氨酸,

文档评论(0)

cxd611 + 关注
文档贡献者

该用户很懒,什么也没介绍

1亿VIP精品文档

相关文档