荧光猝灭法研究苯胺蓝与牛血清白蛋白的相互作用.docVIP

【标题】荧光猝灭法研究苯胺蓝与牛血清白蛋白的相互作用 【作者】蒋祥柳 【关键词】苯胺蓝??牛血清白蛋白??荧光光谱法??热力学参数 【指导老师】秦宗会 【专业】环境科学 【正文】1. 绪言牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin Fraction V)是牛体内血浆中含量最丰富的蛋白质，它不仅是维持血浆渗透压的主要力量，在生理上还参与多种内源、外源性物质(如金属离子、脂肪酸、氨基酸、代谢物、胆红素、酶、药物和激素等)的存储和转运[1]，是一种含有多个配位基团的生物大分子。水溶性苯胺蓝（Aniline blue）C32H25N3O9S3Na2是一种具有大共轭体系的三苯甲烷染料衍生物，他曾用作神经组织、细胞质和结缔组织的生物染色剂，在强酸性介质中是一种阳离子染料，但在pH1~3的酸性介质中，它因三个磺酸基质子离解，以两性染料的状态存在，分子的总电荷呈阴离子状态，摄入量过多会对人体的生殖细胞会产生伤害，导致流产、不孕、不育畸胎等症发生；在一定条件下，有可能引起细胞基因突变，可能诱发皮肤癌、膀胱癌等。苯胺染料还能抑制人体骨髓造血功能，可能由此诱发血液癌症——白血病[2]。本文研究了牛血清白蛋白(BSA)与苯胺蓝相互作用后的紫外光谱及荧光光谱变化，其结果对探明牛血清白蛋白生理功能与结构变化的关系提供了部分根据，对生物染料的探索、开发及应用等方面都具有重要意义。2. 实验部分2.1?仪器与试剂F-2500型荧光分光光度计((Hitachi，日本); U?- 3010?紫外/可见分光光度计(Hitachi，日本); pHS-3C?数显酸度计(上海理达仪器厂);?超级恒温槽(南京多助科技发展有限公司)。牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin Fraction V，Sigma, MW?= 65000，纯度：99%)，用水配成1.0×10-5? mol?L-1，苯胺蓝(Aniline blue,?上海试剂三厂,?纯度＞96%)，用水配成1.0×10-4? mol?L-1，置于4?℃?冰箱中保存；三羟甲基氨基甲烷(Tris)为生化试剂，配成0.10 mol?L-1的 Tris-HCl?缓冲溶液(内含0.10 mol?L-1 NaCl，以调节离子强度)，准确pH值用酸度计校准。其它试剂均为分析纯,?实验用水为二次去蒸馏水。2.2?实验方法取十只10 mL?比色管中分别加入1.0 mL1.0×10-5 mol?L-1的牛血清白蛋白溶液,再分别加入0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml、1.0ml?浓度为1.0×10-4mol?L-1的苯胺蓝溶液,?加蒸馏水定容至刻度，分别在15℃、25?℃、37?℃的水浴中恒温1 h后，测定各体系的荧光光谱。测定条件：比色皿厚为1 cm，激发和发射狭缝宽度均为5 nm,?激发光波长λex?= 280 nm，扫描速率1200 nm?min-1;并扫描紫外光谱。3?结果与讨论3.1?紫外吸收光谱?图1??苯胺蓝对牛血清白蛋白紫外光谱的影响Fig.1 Effect of Aniline blue on ultraviolet spectra of Bovine Serum Albumin Fraction VpH7.40, cBSA?/(mol?L-1):1.0×10-5, 105cANB/(mol?L-1): 0, 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8 from 1 to 9固定牛血清白蛋白（BSA）溶液浓度不变，改变苯胺蓝浓度，以水为参比，紫外扫描混合溶液的吸收光谱(图1)。可以看出，随着苯胺蓝浓度的增加，在扫描波长范围内吸光度有规律的增大，在牛血清白蛋白的紫外最大吸收峰处，苯胺蓝无吸收，吸光度同样有规律的增加，这表明苯胺蓝与牛血清白蛋白之间存在较强的相互作用，形成了复合物[3]。3.2?荧光光谱苯胺蓝本身没有荧光，蛋白质能够发出荧光，是因为蛋白质中存在三种芳香族氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸，由于这些氨基酸结构不同，通常荧光强度比为100∶9∶0.5，因此通常认为蛋白质所显示的荧光主要来自色氨酸残基，而且含色氨酸残基的蛋白质的天然荧光及其变化值可以直接反映蛋白质中色氨酸残基本身和周围环境的变化[4]。由图2?可知，在280 nm?激发波长下，苯胺蓝使牛血清白蛋白的荧光发生猝灭,?且随苯胺蓝浓度的增加，血清白蛋白的荧光强度逐步降低,?降低的幅度越来越小，而蛋白质的发射峰的峰位及峰形基本保持不变。也表明两者之间存在着相互作用,?且随苯胺蓝浓度的增加二者的结合趋向饱和。3.3?蛋白质荧光猝灭过程速率常数和机制????荧光猝灭作用因猝灭机制不