壳聚糖的酶解法降解及.pptVIP

* * 实验三 壳聚糖的酶解法降解及　　　　其动力学 　　　　　　　　　　　 以木瓜蛋白酶催化降解壳聚糖，并考察这一酶促反应过程的动力学 一 实验内容 壳聚糖 壳聚糖的酶降解 降解产物低聚壳聚糖 可有效地降低血压、血糖和血脂；增强免疫力和抗疾病的能力；调节肠道的微生物生态平衡等。 二 实验目的 1．??? 了解酶水解壳聚糖的原理和方法 2．??? 加深对酶促反应过程和其应用的认识 3．??? 掌握还原糖浓度的测定方法 4．??? 掌握反应初速度的测定 三 实验主要材料 1、木瓜蛋白酶 2、壳聚糖 3、N-乙酰-D-氨基葡萄糖 4、铁氰化钾 5、紫外分光光度计 6、控温摇床 7、离心机 8、水浴锅 9、电炉 四 实验步骤 1、壳聚糖溶液的配制 称 2 g壳聚糖于250mL烧杯中，加入200 mL的乙酸-乙酸钠缓冲液（pH=4.6），不断地进行搅拌，直至完全溶解。 2、木瓜蛋白酶溶液的制备 取12 mg的木瓜蛋白酶于5mL离心管中，加入1 mL pH=4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，在旋涡振荡器上振荡使其溶解，保存待用。 3、壳聚糖的酶水解 将壳聚糖溶液加入锥形瓶中，置于控温摇床（45℃，120 rpm）中。20min后，取出1mL，测其还原糖浓度，作为反应起始点的还原糖浓度。加入1mL木瓜蛋白酶溶液开始降解。 每隔15min取出1mL，95℃水浴15min使酶灭活,然后测定还原糖浓度。第2个小时开始每20min取一次样，测其还原糖浓度。当OD值小于0.1时，应适当稀释。反应2小时后结束实验。 五 方法 还原糖浓度的测定采用Imoto改良法。 显色剂：称取0.5g铁氰化钾，溶解于1L 0.5mol/L的碳酸钠溶液中，然后存放于棕色瓶中。 （一）还原糖标准曲线的绘制 准确配制0.2mmol/L，0.4mmol/L，0.6mmol/L，0.8mmol/L，1.0mmol/L和1.2mmol/L的N-乙酰-D-氨基葡萄糖标准溶液。 分别取1.0mL，加入4.0mL显色剂，摇匀。 塞上塞子，在沸水浴中加热15min。 冷却，在波长420nm处，以蒸馏水做空白，测定吸光度A。再取1.0mL 蒸馏水加4.0mL显色剂，测其420nm处的吸光度A0。 计算△A=A0-A，得到一系列对应不同浓度N-乙酰-D-氨基葡萄糖溶液的△A值。以△A值对N-乙酰-D-氨基葡萄糖溶液的浓度作图，得标准曲线。 （二）还原糖浓度的测定 在试管中加入1.0mL 降解后的壳聚糖溶液和4.0mL显色剂，摇匀； 塞上塞子，在沸水浴中加热15min； 冷却，8000r/min离心10min; 取清液，在波长420nm处，以蒸馏水做空白，测定吸光度A。再取1.0mL 蒸馏水加4.0mL显色剂，测其420nm处的吸光度A0。 计算△A=A0-A，根据标准曲线方程得出还原糖的浓度。 六 实验结果的记录 和数据处理