医学论文：实时fq－pcr与时间分辨荧光免疫分析法检测乙型肝炎分析.docVIP

???????????? 作者：薄红霞 冯育英 韩红燕 刘佳 摘? 要? 目的：探讨实时荧光定量聚合酶链反应(fq-pcr)定量检测乙型肝炎病毒(hbv-dna)与时间分辨荧光免疫分析法对乙型肝炎免疫标志物(hbv-m)检测对乙型肝炎实验室诊断的敏感性。方法：采用两种方法分别对800例本院传染科住院及门诊可疑病人血清标本进行检测。结果：用fq-pcr 检测800例，hbv-dna阳性例数602，阳性率 87.81%，用时间分辨荧光免疫分析法检测800例，hbv-m的阳性例数477，阳性率59.63%，通过χ２检检，χ２=2.98，p 0.05。结论：在乙型肝炎的实验室诊断中，fq-pcr检测乙型肝炎病毒hbv-dna更优于时间分辨荧光免疫分析法检测乙型肝炎免疫标志物hbv-m。 　　关键词? 乙型肝炎；聚合酶链反应；时间分辨荧光免疫分析　　乙型肝炎病毒(hepatitis b virus，hbv)是严重危害人类健康的病毒之一，hbv感染后参考血清免疫学标志物如hbsag、hbsab、hbeag、 hbeab、hbcab(即乙肝两对半；hbv-m)等，它们的敏感性及特异性可满足一般临床应用。但近几年研究发现由于一些hbv变异株的出现导致临床部分患者的hbv感染复制状况难以判断，甚至漏检。定量pcr检测hbv-dna可对乙肝患者体内hbv复制有更直接的了解，亦有利于临床对hbv感染的诊断、治疗方案的选择及疗效判定。本实验采用荧光定量pcr(fq-pcr)和时间分辨两种方法同时检测了800份肝炎患者血清，并对结果进行了对比观察，现报告如下。　　1? 材料和方法　　1.1? 材料　　? 研究对象：　　为2005年10月～2005年12月本院传染科住院及门诊病人800例。　　? 试剂与仪器：　　实时fq－pcr试剂盒购自中山医科大学达安基因股份有限公司。dna扩增仪为美国产abi7000。 时间分辨荧光免疫分析法试剂盒购自上海新波技术有限公司，hbv－m仪器为上海新波生物技术有限公司生产的时间分辨荧光免疫分析。　　1.2? 方法　　? 标本采集与保存：　　　　　无菌抽取受检者静脉血2ml，8,000rpm离心5min，吸取上清（注意勿带入红细胞）。标本可立即用于测试，也可保存于-20待测。　　? 标本的处理和dna的提取：????? 　　取血清标本50μl，加等量dna提取液打匀，恒温金属浴10min(误差不超过1min)。10,000rpm离心5min，取上清液5μl做pcr反应。　　? 标准品稀释和处理：严格按照hbv-dna fq-pcr试剂盒说明书将阳性定量质控标准品进行稀释和处理，最后与标本一同点样上机。　　设置pcr程序为932min预变性，然后按9345s→55℃60s ，先做10个循环，最后按9330s→55℃45s，做30个循环，所有检测均由同批检测人员进行操作及分析。　　2? 结果????? 　　hbv-dna定量测量结果：800例肝炎患者血清标本中，350例hbv-dna阳性，450例阴性，阳性最低滴度为2.74×103copies/mｌ，最高滴度为8.73×108copies/mｌ。其中乙肝大三阳组hbv-dna检出率为95.83％；乙肝小三阳组hbv-dna 检出率为43.48％；hbsag、hbcab(+)组hbv-dna检出率高达40.00％；所有hbsab(+)组均未检出hbv-dna；hbv-m全阴组hbv-dna 检出率为2.17％。见表1～表3。表1? 用fq-pcr检测病人hbv-dna的结果hbv-dna定量测定值范围（略）注：试剂盒的检测下限 103为阴性。表2? 用时间分辨荧光免疫分析法检测病人hbv-m的结果（略）表3? 两种方法对乙型肝炎患者血清标本检验结果比较（略）　　3? 讨论????? 　　通过上述两种方法对800例临床血清标本的检测，fq-pcr检测hbv-dna的阳性检出率87.81%,用时间分辨荧光免疫分析法检测hbv-m的阳性检出率59.63%,两种方法的χ2检验,p 0.05,说明两种方法对乙型肝炎病毒的检测有明显的差异。　　在216例乙肝大三阳患者血清中检出hbv-dna阳性207例，检出率达95.83％，定量结果在1.82×106copies/mｌ～8.73×108copies/mｌ之间，说明“大三阳”与hbv-dna是有显著相关的。但是，不同个体病毒复制程度差异较大，其中有9例hbeag阳性但hbv-dna定量检测结果阴性，这9例服用拉米夫啶进行抗病毒治疗者，使hbeag阴转明显滞后，所以“大三阳”与hbv-dna并不能划上等号，在抗病毒治疗过程中，两者均获得转阴，可认为抗病毒治疗疗效显著；如果其中一项阴转，则说明有效，但仍需继续抗病毒治疗，直到两项病毒指标