医学论文：鳖甲抗肝纤维化活性组分.docVIP

浅谈?????????????? 作者：唐尹萍，胡春玲，施婧妮，高建蓉，姚航平，刘焱文【摘要】? 目的 筛选鳖甲抗肝纤维化的活性组分。方法 传代培养的hsc-t6与鳖甲bj61～bj68共同培养72h后，采用mtt比色法测定各浓度组hsc-t6的增殖情况。结果 bj61～bj65和bj68对hsc-t6细胞无抑制作用，而bj66和bj67有较强的抑制作用。结论 bj66和bj67为鳖甲的活性组分。 【关键词】? 鳖甲;活性组分;mtt比色法　　abstract objective to screen the active constituent from carapax trionycis. methods secondary culture hsc-t6 in vitro,which was co-cultrued with bj61-bj68 ,then mtt assay was applied to detect the impacts of trionyx sinensis at different concentrations on hsc-t6. results bj61 - bj65 and bj68 had no inhibitory effect on hsc - t6 cells, but bj66 and bj67 had a stronger inhibitory effect on hsc - t6 cells. conclusion bj66 and bj67 is the active constituent from carapax trionycis. 　　key words carapax trionycis ;active constituent;mtt 　　鳖甲为鳖科动物鳖 trionyx sinensis wiegmann 的背甲，具有滋阴潜阳、软坚散结、退热除蒸的功效1。鳖甲常用于治疗慢性肝病、预防肝硬化2～4, 是治疗肝纤维化疾患的常用中药，但鳖甲的活性成分鲜见报道。本实验依据活性筛选的思路, 在高建荣等5确定分子量小于6000的多肽为鳖甲抗肝纤维化活性部位的基础上，采用葡聚糖凝胶g-25、葡聚糖凝胶g-15进一步分离为8个组分，再用mtt比色法进一步筛选鳖甲抗肝纤维化的活性组分,为后续的筛选活性单体奠定了基础。　　1 材料与方法　　1.1 材料　　1.1.1 对象 大鼠肝星状细胞系(hsc-t6)由浙江大学附属第一医院肝病研究所提供。　　1.1.2 试验药物及主要试剂 (1)试验药物：鳖甲(醋制品)由浙江衢化医院提供，粉碎后过80目筛。(2)细胞培养试剂：胰蛋白酶(trypsin)、非必需氨基酸(neaa)、 high-dmem培养基，gibco产品 ;胎牛血清，武汉三利生物技术有限公司产品;青霉素、链霉素，华北制药股份公司产品;二氧化碳(co2)，武汉市明辉气体科技有限公司。(3)细胞增殖用试剂：二甲基亚砜 (dmso)、噻唑蓝 (mtt)，武汉凌飞科技有限公司。(4) 葡聚糖凝胶g-25、葡聚糖凝胶g-15:北京慧得易公司。　　1.1.3 仪器 co2培养箱，日本 sanyo公司产品;全自动酶标仪，美国 bio-rad公司产品;倒置相差显微镜，日本olympus公司产品;洁净工作台，上海博迅医疗设备厂产品。　　1.2 试验方法　　1.2.1 鳖甲透析物干燥粉末的制备 精密称取鳖甲粉末100g，加200ml双蒸水超声提取20min，抽滤，残渣加水100ml超声10min，抽滤，合并滤液，冷冻干燥得冻干粉。再用少量水将冻干粉溶解，装于透析膜内，用100ml水于4℃透析5h，透析2次，合并膜外溶液，冷冻干燥。最后得鳖甲干燥粉末为淡黄色絮状粉末，即为鳖甲的抗肝纤维化活性肽类物质5(m6000)。　　1.2.2 鳖甲抗肝纤维化活性部位不同组分的分离 称取50g葡聚糖凝胶g-25(sephadex g-25)，加入过量双蒸水，加热溶胀约2h，放置冷却至室温，装柱。取0.3653g醋鳖甲透析物干燥粉末，用双蒸馏水8ml溶解，加入色谱柱上端，用蒸馏水洗脱，收集流分，每份10ml，共收集8个流分，即将鳖甲抗肝纤维化活性肽类物质分离为8个部位，分别记录为bj1～bj8，其中bj4、bj6和bj7为活性部位6。再称取70g葡聚糖凝胶g-15(sephadex g-15)，加入过量双蒸水，加热溶胀约2h，放置冷却至室温，装柱。取0.4012g bj6样品，用双蒸馏水5ml溶解，加入色谱柱上端，用蒸馏水洗脱，收集流分，每份10ml，共收集8个流分，即将鳖甲抗肝纤维化活性部位bj6分离为8个组分。提取分离流程见图1。　　图1 提取分离流程1.2.3 hsc的培养及传代 将传代的hsc-t6培养于含10