卷丹百合rapd-pcr反应程序的优化研究.docxVIP

卷丹百合RAPD-PCR反应程序的优化研究RAPD (随机扩增多态性DNA，RandomAmplifiedPolymorphicDNA)是1990年在PCR基础上发展起来的分子标记技术（Williams,1990;Welsh,1990），因其具有简便、快速、灵敏、多态性检出率高、所需DNA量少、无需预先知道基因组DNA的序列、无需探针标记和杂交等特点，己在植物亲缘关系、品种鉴定、遗传多样性检测、遗传图谱的构建与基因定位、突变体的鉴定以及育种材料的早期选择等方面得到了较多的应用。但RAPD技术易受外界因素的影响，试验的重复性和稳定性较差。因此，必须建立一个稳定的反应程序。本实验采用正交设计和单因素实验相结合的方法，对卷丹百合RAPD反应程序中各影响因素进行优化，以期建立RAPD反应的最佳程序，为在分子水平研究百合种质资源的分类及亲缘关系奠定基础。1材料与方法1.1试验材料植物材料为卷丹百合，取自沈阳农业大学花卉基地。1.2试验方法1.2.1基因组DNA的提取取卷丹叶片，用CTAB法提取DNA[1]。将样品稀释后用紫外可见分光光度计测定OD260/OD280值，估算样品的浓度，并结合0.8％琼脂糖（TaKaRa）凝胶电泳确定其含量和完整性，然后稀释至40ng/μl。1.2.2正交设计优化RAPD反应程序选择退火时间、延伸时间和循环次数3种因素，每种因素选定4个水平，设计因素水平表（表1）。采用正交设计表L16（43）安排试验（表2）。可同时设置退火梯度：36℃，37℃，38℃，39℃，40℃，42℃。所用试剂为MgCl225mmol/L，dNTP（Biosharp公司）10mmol/L，引物（S1383，上海生工）20ng/μl，Taq DNA聚合酶（Promega公司）5U/μl。反应体系为：20μl反应体系中包含2μl buffer，模板DNA2.0μl，Mg2＋2.0μl，dNTP1.2μl，引物2.0μl，Taq DNA聚合酶0.2μl。1.2.3单因素逐项优化RAPD反应程序对退火温度和时间、延伸时间和循环次数进行单因子试验，逐项优化。其梯度处理和反应体系同1.2.2，其他因素固定时为：退火时间为50s，延伸时间为100s，循环次数为45。反应在TC-512 PCR仪中进行，扩增结束后，在反应混合物中加入5μl溴酚蓝，混匀。取10μl点入含0.5μg/ml溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中，于1×TBE电泳缓冲液中、120V电场下电泳90分钟，然后在GelDoc凝胶成像系统（BIO-RAD）中观察、照相。2结果与分析2.1 正交设计优化RAPD反应程序由图1可以看出，C、J、M、N、O和P组合扩增效果较好，条带清晰。不同的反应程序组合中出现的条带清晰度不同，有的甚至没有出现扩增带。退火时间短，引物同单链DNA结合不充分，可能导致扩增产物较少（如A、B、C、D）。延伸时间主要根据欲扩增片段的长度来确定，延伸时间过多能够导致非特异性扩增，延伸时间过少产物片段大小不稳定（如A、E、I）。循环次数太少PCR产物量极低，甚至不能扩增出带（如A、F、K），说明反应不完全；循环次数过多，一旦达到平台期，以后的循环不会使产物明显增加，反而可能引起非特异性扩增。表1 RAPD-PCR反应程序中各影响因素水平水平数退火时间(s)延伸时间(s)循环次数130603524080403501004546012050表2 L16(43) RAPD-PCR反应程序正交试验设计表处理退火时间延伸时间循环次数A111B122C133D144E212F221G234H243I313J324K331L342M414N423O432P441M A B C D E F G H I J K L M N O P图1 正交设计反应程序的PCR产物电泳结果（注：A-P为处理号参见表2）M A B C D E F G H I J K L M N O P图1 正交设计反应程序的PCR产物电泳结果（注：A-P为处理号参见表2）Fig. 1 Electrophoresis result of different RAPD-PCR procedure with orthogonal design (Note: A-P showed in Table 2)2.2 单因素逐项优化RAPD反应程序由图2可以看出，退火时间为30s时，扩增条带较弱，可能由于时间过短，引物同变性后的单链DNA结合不充分；退火时间在40-60s内，对RAPD反应的影响不大。由图3可以看出，60-100s已经能够充分延伸，当延伸时间为12