水稻蛋白质组学研究.docVIP

水稻蛋白质组学研究 1 蛋白质组学研究方法 　　蛋白质组学经典的研究方法是双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Two-dimensional PAGE，简称 2-DE)技术。1975年 OFarrell 首次使用该技术分离大肠杆菌的蛋白质，后来发展的固相 pH 梯度 (IPG) 技术，解决了 2-DE 中 pH 梯度的不稳定性，Gorg 等详述了聚焦参数的选择。双向电泳后的凝胶经过染色(如银染、考马斯亮蓝染色等)，然后用图谱软件分析及后续的质谱或氨基酸序列等分析，再通过数据库检索最终达到鉴定蛋白质的目的。目前商品化及非商品化的图像分析软件相当多，如 PD Quest，Melanie，Image 2D Elite，Z3，Progenesis 等。 　　质谱 (Mass Spectrometry) 原理是将蛋白质样品分子离子化，然后通过质荷比分离并确定其分子量。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MALDITOF-MS) 和电喷雾电离质谱 (ESI-MS) 两项软电离技术的出现，促进了蛋白质高通量的鉴定研究。 近来出现的 MudPIT 多维蛋白质鉴定技术，将蛋白质混合物使用两向分离技术进行分离，第1向使用强阳离子交换，第2向使用反向色谱，然后用质谱鉴定。与普通的 2-DE 方法独立互补，代表了当前最丰富的蛋白质分离鉴定技术。另外出现的 DIGE 技术(差异显示凝胶电泳)，用3种不同的荧光染料 (Cy2，Cy3，Cy5) 标记不同的样品，在同一块凝胶上电泳，通过不同波长的激光及发射过滤器扫描，产生3种不同颜色的荧光信号。克服了不同凝胶间电泳造成的蛋白点的位置和量的差异，减少了凝胶使用量，增加了凝胶间的可比性。 （/zt/experiment/ 生物实验技术） 　　目前蛋白质组学研究出现的许多新技术，大有取代 2-DE 的趋势，但考虑到试验费用，应用能力以及使用的广泛性，2-DE 依然有前景，特别是与免疫检测结合使用，其仍然是蛋白质组学研究的重要工具。功能蛋白质组学研究涉及蛋白质的活性，因此需考虑翻译后修饰及蛋白质问的相互作用，蛋白质的相互作用是生命活动的基础，一切生命活动几乎都是通过蛋白质间的相互作用而实现的。目前用来检测蛋白质相互作用的方法有酵母双杂交系统法，蛋白质芯片法，噬菌体展示技术等。 2 蛋白质组学在水稻中的应用 　　1)发育的蛋白质组学研究。在蛋白质组学概念提出来之前，许多研究者就已采用 2-DE 技术对水稻各组织器官的蛋白质组分进行分离及比较，Komatsu 等用 2-DE 分析水稻胚、胚乳及叶的蛋白质，考马斯亮蓝染色后分别检测出约600、100、150个蛋白点，通过 N 端或内部氨基酸测序，鉴定了27种蛋白质，超过70％的蛋白质 N 端封闭。Tsugita 等对水稻10种组织器官分离出 4892 个蛋白质，对其中2.8％的蛋白质进一步分析，只有1.1％(56个)测序，由于当时基因组及蛋白质数据库有限，即使一些被测序的蛋白质也不知其功能。水稻重要的繁殖器官花药在小孢子早期发育易受环境影响，Imin 等通过 2-DE 分离、银染得到约4000种花药蛋白，代表了整个基因组的10％，其中53个点得到鉴定，大部分是持家蛋白，分子伴侣，富甘氨酸蛋白，以及调控翻译的肿瘤蛋白(首次在花药研究中报道)等。同时，一些与代谢密切相关的亚细胞结构也开展了蛋白质组学研究，如水稻线粒体，通过质谱分析鉴定了149个蛋白，并确定了其中85个蛋白质的功能。在制备亚细胞蛋白质样品时，如有必要可先用显微激光切割技术进行专一样品的富集后再进一步裂解。其他涉及研究的亚细胞结构还有质膜，高尔基体膜，叶绿体等。目前水稻蛋白质组数据库包含了23张参考图，有详细的采样部位、样品制备及电泳条件，鉴定方法，点击蛋白点链接相应的信息等 　2)在环境胁迫下的蛋白质组学研究。基因的表达受各种环境因子的影响，主要包括生物和非生物因子胁迫等。用各种胁迫处理水稻，可以分离新的蛋白及基因，同时可深入了解水稻对这些环境胁迫的适应机制。水稻对干旱胁迫相当敏感，干旱严重影响水稻的产量。Salekdeh 等对干旱胁迫下以及恢复灌溉后水稻叶片蛋白质组进行分析，发现干旱胁迫下有42个蛋白点的丰度有显著变化，从而鉴定了一些干旱应答蛋白，这将有助于提高水稻抗旱育种以及改善作物品质和提高产量。 （/zt/ 生物专题） 　　Agrawal 等采用 2-DE 结合氨基酸测序及免疫杂交技术研究臭氧胁迫下水稻幼苗叶蛋白的表达，与对照相比，50多个点有差异，其中与光合作用相关的主要蛋白 RuBisCO 减少，另外诱导出与防御有关的蛋白累积，包括 OsPR5，O