2011分子生物学研究方法总复习刘剑老师pdf.pptVIP

原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 用途：检测RNA样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 （二）Northern Blot 操作过程 mRNA提取 甲醛变性电泳 印迹转移 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或化学发光 三　斑点杂交： 将PCR 产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜薄膜上 寡核苷酸探针杂交 观察有无着色斑点 主要用于 PCR产物特异性鉴定等。 何谓SNP(单核甘酸多态性)？ 虽然同种生物其染色体差异极小,但平均1000个碱基对(base pair)就有一个发生突变,这些变异称为SNP,是造成个体的血型、身高、对药物的敏感性等差异的原因。此外,SNP也和癌症、心血管疾病、自体免疫等等疾病有关。 5.2.5 单核苷酸多态性(SNP) １.定义 单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个 核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种 变异可由单个碱基的转换所引起，也可由碱 基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后 两种情况。 3. SNP的意义 对于人类来说，SNP的意义在于： 致病SNP 疾病易感性SNP 人表型相关SNP 药物作用与不良反应的SNP * 分子生物学研究方法 刘剑 2.限制性核酸内切酶的命名原则 1973年，1980年进行了系统分类 ①限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名;第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名。 ②第四个字母代表宿主菌的株系或型。 ③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。 限制性核酸内切酶的命名原则： 　　　属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌d株 HindⅡ HindⅢ 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 4.Ⅱ型限制性核酸内切酶的功能 　Ⅱ型限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，识别序列一般为4～8个碱基对，具有回文结构。它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH。Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口。 EcoRⅠ的识别序列 5’- GAATTC-3’ 3’- CTTAAG 5’ ６.Ⅱ限制性核酸内切酶的星活性 指由于反应条件改变，酶切的核酸序列不同于它特定 的识别序列,即酶切反应的特异性发生了改变。 5.2.2 　DNA分子的连接　（运用DNA连接酶进行连接） DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5′-磷酸根和3′-羟基生成磷酸二酯键。这种反应需要能量。大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。 ??? 细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致遗传性状特征发生改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。 处于能够接受外源DNA状态的细胞称为感受态细胞。 5.2.3 细菌转化 5.2.3 核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA片段的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的分子生物学研究方法。 ? 在一般情况下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。 大分子量的DNA 移动的慢 小分子量的DNA 移动的快 电泳缓冲液 阳极 阴极 DNA加样孔 2.4. PCR(聚合酶链式反应)及其应用概念：在引物指导下由酶催化的对特定DNA序列进 行的体外扩增反应。由多个循环组成。每个循环包括了变性、退火以及延伸三个阶段。 PCR 循环 – 第一步 – 加热变性 靶序列 靶序列 PCR 循环- 第二步 – 引物与靶序列退火 靶序列 靶序列 Primer 1 Primer 2 Biotin Biotin 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ PCR 循环 -