家蚕杆状病毒表面展示Dll4蛋白的肿瘤疫苗的研究.docVIP

  家蚕杆状病毒表面展示 Dll4 蛋白的肿瘤疫 苗的研究# 张浩1，张耀洲2** 5 10 15 20 （1. 浙江理工大学生命科学院，杭州 310018； 2. 天津市国际生物医药联合研究院，天津 300457） 摘要：Dll4 蛋白是 Notch 信号通路的一个配体，在血管生成过程中起到关键作用。据研究， 在许多肿瘤中如乳腺癌，胃癌等都存在 Dll4 蛋白过表达现象。当封闭 Dll4 通路时肿瘤会因 所生成的血管分支过多，无功能化，无法正常输送氧气和营养从而抑制肿瘤的生长。将人源 Dll4 基因用重叠 PCR 方法将其与家蚕杆状病毒信封蛋白 gp64 的信号肽序列和跨膜区序列连 接，将其连接于 pFastBac1 载体对克隆位点 BamH1 和 Xhol1 两个酶切位点之间。利用 Bac-to-Bac 系统，将其构建成表面展示 Dll4 蛋白的杆状病毒。将构建好的载体 pFastBac1Dll4 转化大肠杆菌 DH10Bac，进行蓝白斑筛选。提取 Bacmid 基因组，用脂质体转染家蚕细胞。 转染六天后，可见细胞明显发病，提取病毒基因组鉴定。再转接病毒于大瓶家蚕细胞，三天 后，将病毒上清液 50000rpm 超速离心 45min，用 PBS 重悬沉淀，进行 30%和 60%的蔗糖梯 度密度离心，收集区带，脱糖后，取少量制样，进行 Western Blotting 鉴定。将脱糖后获得 的病毒进行蛋白定量后，以每份 100μg 粗蛋白注射免疫 C57BL/6 小鼠。每隔七天进行一次 免疫，连续免疫 3 次，第三次免疫后第二天给小鼠接种小鼠 Lewis 肺癌细胞。每隔一日检查 并记录肿瘤生长情况。接瘤 12 天后，对实验小鼠眼眶取血，并拉颈处死，剥取瘤体，测量 体积。将所取的血清用 ELISA 检测 Dll4 抗体效价。经检测，在 10μg/mL 抗原包被的情况 下疫苗组小鼠血清中 Dll4 效价为 1：3200。与对照组比较，疫苗免疫组的肿瘤体积约为对照 组的 50%。 关键词：分子生物学；杆状病毒；Dll4、肿瘤疫苗 中图分类号：R73-36+2 25 The inhibition of immuning BmNPV displaying Dll4 to mice lung caner ZHANG Hao1, ZHANG Yaozhou2 (1. Zhejiang Sci-Tech University School of Life Sciences, HangZhou 310018; 30 35 40 45 2. Tianjin International Joint of BiotechnologyMedicine, TianJin 300457) Abstract: It is report that Dll4 have be detected over expression in majority kinds of cancer such as breast cancer，gastric cancer，lung cancer. When blockade Dll4 function results in hyper sprouting due to the loss of lateral inhibition of the endothelial tip cell phenotype mediated through Notch1. As a consequence, an excessive, but nonproductive, angiogenic response is mounted, characterized by poor perfusion that results in hypoxia. Amplified human Dll4 gene and signaol Pepitide, transmembrane area of gp64 with PCR then spliced with overlap extension PCR. Clone the SP-Dll4-TM into pFastBac1 between BamH1 and Xhol1 clonesite, Transformating pPastBac1gp64Dll4 into DH10Bac, choosing white spot culture and extracting Bacmid genome, using liposome transfect into BmN cell. After six days, cell loat obviously. Extract viral genome, PCR