应用酵母单杂交技术筛选BmNPV多角体基因启动子结合蛋白.docVIP

  应用酵母单杂交技术筛选 BmNPV 多角体基 因启动子结合蛋白# 李佳1，高珍1，王美惠1，陈健1，吕正兵1，聂作明1，张耀洲1,2，于威1** 5 10 15 20 25 30 35 40 45 （1. 浙江理工大学生命科学学院，杭州 310018； 2. 天津市国际生物医药联合研究院，天津 300457） 摘要：本研究以家蚕杆状病毒（BmNPV）为研究对象，筛选其多角体基因高效转录过程中与 启动子序列相互作用的结合蛋白。通过提取感染 BmNPV 第 5 天的家蚕五龄虫脂肪体组织的总 RNA，利用 RT-PCR 技术建立了家蚕五龄幼虫组织的基因表达文库，同时设计并合成了用于调 控因子筛选的多角体基因启动子关键序列，采用酵母单杂交系统从构建的家蚕组织 cDNA 文 库中筛选与该基因启动子相互作用的蛋白因子。经过多轮筛选后，共获得 12 个阳性克隆仍 保持 AbA 抗性，提取相应酵母菌单克隆中的质粒进行测序分析，发现它们分别属于 2 个不同 蛋白的 cDNA 克隆。进一步对筛选出的 cDNA 序列进行生物信息学分析，发现它们分别编码宿 主来源的核糖体蛋白 RPSA（ribosome protein derived，RPSA）和 BmNPV 来源的核型多角 体病毒 DNA 结合蛋白（DBP）。为进一步验证筛选出的蛋白因子 RPSA 和 DBP 对多角体基因启 动子活性的影响，分别将 RPSA 和 DBP 基因插入瞬时表达载体 pSK-IE 中，转染 BmN 细胞，24 h 后感染重组病毒 Bacmid-Luc，然后检测荧光素酶的表达量。结果表明 RPSA 蛋白和 DBP 蛋 白对多角体基因转录均具有正调控作用。RNAi 检测结果表明 RPSA 和 DBP 干扰后对多角体基 因转录水平均具有下调作用。本研究工作从分子水平探索了多角体基因启动子高效转录、表 达的作用机制，为今后深入研究杆状病毒启动子转录机制奠定了基础。 关键词：分子生物学；BmNPV；酵母单杂交系统；多角体启动子；DNA 结合蛋白；转录调控 中图分类号：Q78 Screening of Proteins Binding with polh Promoter of BmNPV by Yeast One-hybrid System Li Jia1, Gao Zhen1, Wang Meihui1, Chen Jian1, Lv Zhengbing1, Nie Zuoming1, Zhang Yaozhou1,2, Yu Wei1 (1. Zhejiang science and technology university, HangZhou 310018 2. Tianjin Intemational Joint Academy of Biotechnology Medicine, TianJin 300457) Abstract: Polyhedrin gene promoter plays an essential role in regulating foreign gene expression in BEVS, but the high-level transcription mechanism is still unknown. One-hybrid screening in yeast is a powerful method to rapidly identify heterologous transcription factors that can interact with polyhedron promoter DNA sequence. Total RNA was extracted from silkworm fat body of fifth instar larvae infected by BmNPV for five days, cDNA for silkworm gene expression library construction was generated by RT-PCR technique. Key polyhedron promoter bait sequence was synthesized to generate the bait yeast strain which was used to screen the one-hybird cDNA libray. 12 positive yeast colonies were obtained from SD/-Leu/AbA plates, sequencing analysis showed that they belong to 2 differe