蛋白质的定量测定方法.docVIP

实验 蛋白质的定量测定方法 【实验预习】 1.试比较Folin酚法与考马斯亮蓝染料结合比色法的优缺点。 2.试比较二喹啉甲酸法与Folin酚法的优缺点。 3.凯氏定氮法中在消化样品时，加入浓硫酸，硫酸钾和硫酸铜粉末的目的是什麽？ 4.紫外吸收法测定蛋白质含量的原理是什麽？ 一、Folin酚试剂法(Lowry法) 【实验目的】 1.学习Folin酚试剂法测定蛋白质含量的原理。 2.掌握Folin酚试剂法测定蛋白质含量的方法和操作。 【实验原理】 蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基，能与Folin酚试剂起氧化还原反应。反应过程分为两步，第一步：在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成蛋白质Cu2+复合物；第二步：蛋白质Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。 该呈色反应在30分钟内即接近极限，并且在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故可用比色的方法确定蛋白质的含量。进行测定时要根据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波长：若蛋白质含量高时（25100μg）在500nm波长处进行测定，含量低时(525μg)在755nm波长处进行测定。最后根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。 Folin酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一。 【