第五章 目的基因与克隆载体的体外重组.pptVIP

第五章 目的基因与克隆载体的体外重组 在选择外源DNA同载体分子连接反应的程序时需考虑3个因素： 实验步骤要简单易行； 连接形成的结点序列，应能被某种限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段； 对转录和转译过程中密码结构的阅读应不发生干扰。 5.1 目的基因与质粒载体的连接 5.1 目的基因与质粒载体的连接 5.1.1 粘性末端连接法 粘性末端连接法的一般程序 防止载体自身再环化 具体操作方法 粘性末端连接法的缺点 5.1.2 定向克隆法 优点 制备定向克隆载体时应注意的几个问题 用两种不同的限制酶消化后，应通过凝胶电泳或大小排阻凝胶层析纯化载体大片段，以便与切下的小片段分开； 尽量避免使用在多克隆位点上彼此直接相邻的限制酶位点； 必须检查两种限制酶对载体的消化是否完全。 5.1.3 平末端连接法 平末端的产生 某些限制酶切割 mRNA→cDNA PCR扩增 平末端连接的特点 低效 重组后一般不能原位删除 平末端连接反应的条件 极高浓度的T4噬菌体DNA连接酶 高浓度的平末端DNA和质粒DNA 低浓度的ATP（0.5mmol/L） 不存在亚精胺一类的多胺 5.1.4 同聚物加尾法 同聚物加尾法就是利用末端转移酶可催化dNTP加到单链或双链DNA3’-OH端的能力，在目的DNA和质粒载体上加入互补的同聚物，两者再通过互补同聚物之间的氢键形成可转化大肠杆菌的开环重组