西南印度洋中脊深海沉积物砷抗性菌的富集分离与多样性分析.docVIP

ISSN 0001-6209; CN11-1995/Q 西南印度洋中脊深海沉积物砷抗性菌的富集分离与多样性分析陈双喜邵宗泽国家海洋局第三海洋研究所，国家海洋局海洋生物遗传重点实验室，厦门 361005摘要：为了筛选深海砷抗性菌，了解印度洋中脊深海沉积物砷抗性菌的多样性情况。方法通过砷富集培养，抗性菌通过变性梯度凝胶电泳（DGGE）与16S rDNA 克隆文库法两种手段分析富集物中砷抗性菌的多样性。利用兼并引物PCR，从抗性菌株中克隆与砷抗性相关的基因。结果，分别属于γproteobacteria的个不同的属AS-I1-3的抗性最高，可以在?3 mol/L三价砷存在的情况下生长Pseudoalteromonas tetraodoni IAM同源性最高　(100%)。DGGE分析显示，富集物中的优势菌，其次是盐单胞菌（Halomonas）和海杆菌（Marinobacter）。16S rDNA 克隆文库分析，AS-I1-3序列相同的克隆子占克隆文库的72.5%而菌株AS-I1-5 (Halomonas meridiana, 100%) 和菌株Mn-I1-6（Marinobacter vinifirmus，99%）分别占1%和%。利用兼并引物PCR仅能从株中克隆到与砷抗性相关的基因，表明抗性菌可能有其他的抗性机制。Pseudoalteromonas属的菌株砷抗性菌在大洋环境砷元素的生物地球化学循环中的作用有待进一步研究印度洋；深海沉积物；砷抗性菌； 生物多样性砷元素在元素周期表中位于第33位，是一种类金属广泛存在于岩石圈、水圈和生物圈[1]，它是一种有毒元素，长期饮用高砷水会导致慢性砷中毒和癌症等疾病2]。2001年，世界卫生组织建议将饮用水中砷的最高限度由原来的50 ?g/L降为10 ?g/L。越来越多的证据表明，细菌对砷的氧化还原作用在砷迁移过程中起着关键作用[3]，微生物在砷的生物地球化学循环中的作用得到了地球化学家、微生物学家和环境科学家等的广泛关注越来越多的与砷代谢有关的微生物被不断从环境中分离出来目前报道的抗性菌主要有Bacillus arsenoxydans[4，Pseduomonas arsenoxydans，Xanthomonas arsenoxydans，Achromobacter arsenoxydanss[5?8]Alcaligens faecalis[9]，Zoogloea sp. ULPAs1[10]，Agrobacterium sp. NT-25、NT-26[11]，Hydrogenophaga sp.YED6-4、YED6-21 和YED1-18[12]。这些菌对三价砷的抗性一般在 10×?3 mol/L以下，而报道的最高抗性可达到100×?3 mol/L。它们主要来源于砷污染水[10]，牛羊圈[4?8]，各种矿场[11]和热泉[12]。但对深海沉积物中的抗性菌多样性研究没有报道本研究综合运用富集筛选、PCR-和构建克隆文库多种手段对西南印度洋中脊沉积物样品中砷抗性菌的多样性进行了分析。获得多株砷抗性菌，并对它们的砷抗性范围及抗性基因作了初步分析1 材料方法 1.1 实验材料印度洋中脊沉积物：2005年大洋一号DY105-17A航次采集。站点IR-TVG1：49.6469°（E），37.7719°（N），深度为2851 m。该站点热液活动的未知区，附近有活动热液口。本实验使用的样品为深海表层沉积物，样品采集后置于灭过菌的封闭的采样杯中，于4保存。 1.2 培养基抗砷富集培养基：天然海水中g NH4NO3，.0 g无水乙酸钠g酵母提取物，10 g胰蛋白胨，0.2 g葡萄糖，pH 7.5。2×10?3 mol/L。制备固体培养基时加入15.0 g琼脂PCR相关试剂由TaKaRa 提供；恒温摇床 (上海智诚分析仪器制造有限公司)；上海智诚分析仪器制造有限公司Alpha Innotech 凝胶成像仪（San Leandro, California；PCR仪（Eppendorf）Decode System电泳仪(Bio-Rad公司)。1.2 砷抗性菌的富集和筛选 取深海底泥样品1 g于抗砷富集培养基中（2×10?3 mol/LＮaAsO2），28、200 r /min摇床培养7，取1 mL富集液转接到新的抗砷富集培养基中，转接两次，将次转接的富集液各取2 mL提混合总DNA用，同时将第次转接的富集物梯度稀释后涂布于含　2×?3 mol/L NaAsO2的富集培养基平板上，28温箱培养7后划线分离至纯培养1.3 细菌DNA提取及系统进化分析 菌的DNA提取方法参照文献[13]， 16S rDNA[14]，由上海英骏公司完成测序。测序结果在NCBI进行BLAST分析。 菌群总DNA的提取：充分摇匀每次转接