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[研究与报告] 激光扫描共焦显微镜在检测活体组织和细胞中的应用 The applications of Confocal Laser Scanning Microscopy in living tissue and cell 何其华 （北京大学医药卫生分析中心 10083） 〔文章编号〕1672-8270 （2004 ）04-43-05 〔中图分类号〕R318 ．51 〔文献标识码〕A 摘 要 激光扫描共焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy，以下简称Confocal ） 的功能决定了其在生物医学中的应用及独特的地位，它能对完整的活细胞和组织或固定的细 胞和组织内各种结构进行定性、定量、定时和定位的测量。但其强大的定位和动态测量功能， 使 Confocal 尤其适合于活体组织和细胞的研究。本文简单介绍一下 Confocal 的原理和功能， 着重阐述了 Confocal 在活体组织和细胞中的应用。 关键词 激光扫描共焦显微镜，荧光探针 The function of Confocal Laser Scanning Microscopy made it have special applications in biomedicine ．The proteins in the living cell and tissue or fixed cell and tissue can be localized by confocal ，and the functions of living cell can be measured ．The article gives the simple introductions of the principle and the functions of confocal，and a lot of introductions about its applications in living cell and tissue ． Key Words ：Confocal Laser Scanning Microscopy，fluorescence probes 1 结构及工作原理 传统的荧光显微镜是采用很宽的照明光束照射在整个样品上，样品整个厚度被同时连续 照明，样品的焦平面以及焦平面以外的结构共同成像，造成图像的模糊。这种现象使用高倍 物镜时会更明显，调节聚焦旋钮时除焦平面的结构会成清晰图像外，非焦平面的结构同时成 像，即整个厚度的样品同时成像在目镜中，但却是有些结构清晰、有些结构模糊，这使目镜 中的整个图像分辨率降低，清晰度下降。当样品比较厚时，这种现象尤其突出。而激光扫描 共焦显微镜解决了这个问题。首先选用激光作为光源，激光通过一个照明针孔到达样品，样 品只被一个具有精密几何形状的光点照射，焦平面上只有被照射到的特定点所发射的荧光通 过一个针孔，到达检测器，这个针孔称为探测针孔（见图 1）。计算机以像点的方式将成像 点显示在屏幕上，为了产生一幅完整的图像，该照射点由光路中的扫描系统在整个样品上扫 描，在显示器上达到产生一幅完整图像的目的，这幅图像即为焦平面的共焦图像。共焦显微 镜之所以只检测到焦平面上被照射的点所发射的光，是由于采用了点照明和点探测，而点照 明和点探测是由放置在光源前的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现的。由照明针孔 发射出的光聚焦在物体焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外 的任何发射荧光均被该针孔阻挡，所以照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共 轭的（见图 2 ），也就是说照明针孔和探测针孔具有共同的焦平面，这就是激光扫描共焦显 微镜系统中共焦的真正含义。由上所述，我们知道在显示器上所成的像即为该焦平面的共焦 图像。只要载物台沿着 Z 轴上下移动，将样品新的一个层面移到照明针孔和探测针孔的共 同焦面上，样品的这个新层面又成像在显示器上，计算机将其存在内存中，随着 Z 轴的不 断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像，我们将从共焦显微镜系统获得的连续光切 图像比喻为 “显微CT ”。从这些连续的光切图像，可得到样品真实的三维结构。