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激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用 05 医学实验学 李维 摘要：激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)是当今世界上 最先进的分子细胞生物学分析仪器，利用激光、电子摄像和计算机图像处理系统，使用紫外 光或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上 观察诸如 pH 值、钙离子、膜电位等生理信息及细胞形态的变化，成为形态学、分子细胞生物 学、神经科学、药理学、遗传学、肿瘤免疫学等领域中的新一代强有力的研究工具。本文对 其工作原理、在医学、材料学及海洋生物学领域的应用做简要介绍。 激光共聚焦扫描显微镜在普通光镜基础上引入共聚焦装置，该装置能够排除非焦平面及 焦平面非焦点光斑信息，大大提高分辨率和图象清晰度。在此基础上，由于计算机及相应的 软件技术组合，可以对较厚样品进行连续光学切片及三维重建。 1. 主要构件 一个完整的LSCM系统由几个主要的硬件和一些成像分析软件组成。硬件包括表面荧光显 微镜、激光光源及冷却系统、定位扫描装置、分辨系统、计算机控制系统、显示器和图像输 出打印设备，软件由三维图像分析系统和三维图像文件管理系统构成。详述如下： illuminating pinhole:照明针孔 功能:使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度 的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。且与 detector pinhole(探测器针孔) 及焦平面形成共聚焦装置。 Objective:物镜 Focal plane:焦平面 功能:激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。 该光斑经过 objective,beamsplitter等一系列装置的处理，分别在 illuminating pinhole 及 detector pinhole 两处聚焦。共聚焦的含义由此而来。 detector pinhole:探测器针孔 功能:与 beamsplitter 作用类似，起到空间滤波器的作用。最大限度的阻碍非聚焦平面散射 光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于 样品光斑焦点位置，因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息（两点共 轭）。 PMT：光电倍增管（探测器） 功能:接受通过针孔的光信号，转变为电信号传输至计算机，在屏幕上出现清晰的整幅焦平面 的图象。 激光器 我们可以根据研究究需要选择不同的激光器。 ArUV(351.364nm),HeCd(442nm),AR(457,488,514nm),ArKr(488,568,647nm)Kr(568nm),HeNe( 543nm),HeNe(633nm)等。 多荧光通道：具有多个荧光通道，以实现同时对样品进行多种标记。 2.基本原理 [1] LSCM以单色激光作为光源，并用附设光源针孔(pinhole)使光源成为点光源 。除此之外， 在检测器前方也有一个检测针孔，点光源对标本内焦平面上的每一检测针孔后的光电点扫描， 标本上的被照射点在检测针孔成像，由倍增管或冷电耦合器件逐点或逐线接受，迅速在计算 机监视器屏幕上形成荧光图像，光源针孔与检测针孔的位置相对于物镜焦平面是共轭的，焦 平面上的点同时聚焦于光源针孔和检测针孔，焦平面以外的点不会在检测针孔成像，这就是 所谓的“共聚焦”，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模 糊的缺点。 多通道LSCM还可同屏采集显示 3 个不同发射波长的荧光色及 1 个混合色图像，对研究 2 种或 2 种以上物质的共存有明显优点。在显微镜的载物台上加一个微量步进马达控制载物台 的升降，最小步进距离为 0.1μm，使焦平面依次位于标本的不同层面上，可以逐层获得标本 的各个光学横断面的图像，实现“光学切片”的目的。通过不同的焦平面产生的光学切片， 可得到一块较厚标本的三维图像，这是LSCM最重要的作用之一。将存储在计算机中的光学切 片的焦平面信息结合起来，即可描述该标本的三维图像。目前LSCM最大有效解析厚度为 0.45mm，