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简述全内反射荧光显微术的原理和应用 摘要：全内反射荧光显微术(Total internal reflection fluorescence microscopy TIRFM) 是利用全内反射产生的消逝波激发样品,使样品表面数百纳米厚的薄层内 的荧光团受到激发，再用高灵敏度和高时间分辨率的摄像机CCD 来捕捉 荧光并用计算机进行显像，从而实现对生物样品观测的一种新生技术。 由于消逝波特点及CCD 的优势使全内反射荧光显微镜具有高信噪比和高 时间分辨率，因此它在对单分子的动态观测具有很高的应用价值。本文 将对全内反射荧光显微镜的原理及应用和发展展望作一个简要的介绍。 关键词：全内反射 消逝波 衍射极限 单分子的动态观测 人类自诞生以来不但在不断的改进自己的生产工具，同时也在不断的改 0 引言： 进自己观察世界和了解这个世界的工具，其间显微镜的制造应改说为人类 观察微观世界打开了一扇窗户，它可以称得上是人类观察认识世界上的一 次革命。此后各种新的观察工具相继问世，使人类对微观世界的认识达到 了空前的高度。但是传统的光学显微镜由于受到光瞳远场衍射效应的影响, 存在分辨极限,瑞利将之归纳为R ≥0. 61 λ/nsin θ ,其中λ为成像光波波 长, nsin θ为物透镜的数值孔径,即NA 值，因此光学显微镜空间分辨极限～ 250 nm 。于是人们研制了拥有点分辨率: 0.2nm的电子显微镜。进入80年代， 非光学类扫描探针显微术特别是原子力显微镜的出现更是将成像的分辨 率推进到纳米的精度。但这些显微技术在不同程度上存在系统结构复杂、 成像检测环境要求苛刻等困难，尤其是不能象光学显微术那样提供重要的 光学信息（如偏振态、折射率、光谱等）和进行无损伤性生物活体探测， 这些因素均严格限制了它们在高分辨率细胞成像中的应用。近年来人们开 发出了一系列光学显微镜如：目前国际上公认的最有前途的单分子光学成 像技术有全场相衬显微术、共焦荧光显微术，近场光学扫描显微术[1 ,2 ] 和全内反射荧光显微术.其高的空间分辨率和时间分辨率、无损伤、以及对 单分子活体探测的可行性，使得这些技术在分子生物学、分子化学、激光 医学及纳米材料等领域有着广泛应用，并将对未来的光测技术的发展和科 学的进步产生深远的影响。其中，全内反射荧光显微术是近年来新兴的一 种光学成像技术，它利用全内反射产生的隐失场来照明样品，从而致使在 百纳米级厚的光学薄层内的荧光团受到激发，荧光成像的信噪比很高。这 种方法的成像装置简单，极易和其它成像技术、探测技术相结合，目前已 成功的实现100nm甚至更低的空间分辨率。 1：全内反射荧光显微术的基本原理 1.1 全内反射 全内反射是一种普遍存在的光学现象。一束平面光波从折射率为n1 的介质 进入到折射率为n2 的介质中。入射光在界面上一部分发生反射，另一部分则 发生透射见图1。入射角i和透射角r之间满足关系式 n1sini=n2sinr (1) 图1：光在不同介质传播的光路图 若n1大于n2 ，例如折射率为n1 的是玻璃，折射率为n2 的是液体溶液。当入 射角增大，增大到临界角θc时，这时的透射角为90 °，当入射角大于或者等 于临界角时，光不再透射进溶液，而是发生全反射，。由Snell定律可知 -1 θ=90° θc=sin (n2/n1) (2) 2 由上式可知，当n1大于n2 时，全反射就可能发生。如图2