性控冷冻精液的研究与应用.docVIP

性控冷冻精液的研究与应用 王彦平，李艳华，朱玉林 （北京奶牛中心） 20世纪，人工授精技术的推广应用使优秀种公牛的价值得到了充分利用，而超数排卵胚胎移植(MOET)技术的开发和应用使优秀母牛得以快速繁殖成为奶牛业的两次科技革命。1989年，Johnson等用流式细胞仪成功地分离了X和Y精子，开辟了奶牛业的第三次科技革命-- 性控精液。使用性控精液可以使奶牛所生后代中92％以上都是母犊，充分发挥泌乳这一雌性限性性状的潜能，大大提高牛群的扩繁速度。 1 性别控制技术 性别控制是通过人为干预动物的正常生殖过程，使雌性动物按照人们的意愿生出所需性别后代的一种繁殖新技术。通过性别控制，不但可减少人类性连锁遗传疾病的发生，可挽救濒临灭绝的珍惜物种，而且可选择不同性别的家畜，满足畜牧生产的需要，有效利用性别控制技术将会大大提高畜牧生产的经济利益。X、Y精子分离是性别控制最根本的技术手段，由精子分离而衍生出了人工输精、体外受精和精子卵浆内注射三种可行的性别控制途径。1925年Lush最早根据X精子和Y精子密度差异的原理采用离心法分离兔子的X和Y精子，但受精后出生后代的性别比例与对照组没有显著差异。之后采用的普通物理学分离法、免疫学分离法等仍处于试验阶段，缺乏可靠性和重复性。通过荧光原位杂交技术和流式细胞仪分离法是目前最具重复性、科学性和有效性的精子分离方法。 2 性控冷冻精液的研究 采用流式细胞仪分离哺乳动物精子的技术起源于20世纪70年代末80年代初。其基本原理根据X精子和Y精子DNA含量的差异，通过荧光染料与DNA结合，利用流式细胞分离仪对X和Y精子进行分离。经PCR分析、荧光原位杂交检测、流式细胞仪重分析以及子宫内输精(IUI)、体外受精及胚胎移植(IVF．ET)和卵胞质内受精(ICSI)的结果证实，流式细胞仪分离精子技术是最具重复性、科学性和有效性的精予分离方法。目前，牛、绵羊、猪和兔等的分离精子结合AI、IVF-ET和lCSI等技术，已成功地产下了预期性别的后代；其中牛、猪、兔的分离精子后代已经正常的繁殖出健康的下一代。随着流式细胞仪分离精子速率和准确性的不断提高、技术的不断改进，该技术将越来越广泛地运用予更多畜种的繁殖生产。 2000年以来，随着精子分离速度的不断提高，X Y精子分离技术逐渐进入商业化应用阶段。英国的Cogent公司是世界上第一家利用分离精子技术投入生产的公司。直至2000年7月止，该公司已在其属下的162个农场进行了2000头牛的人工输精（AI），分离精子的平均怀孕率为52％，而非分离精子对照组的为56％。美国XY公司从2000年开始性控精液的商业化生产应用，至今已利用分离X精子冷冻精液对10787头青年母牛进行了人工授精，情期受胎率达到53％。墨西哥X、Y公司于2004年正式大量向市场提供良种奶牛的x精子冷冻精液，分离准确率都在90％以上，用x精子冷冻精液对青年母牛进行人工授精，情期受胎率保持在60％以上。我国奶牛性控精液的实验研究工作起步较晚，但近年来发展迅速。2001年10月，黑龙江省大庆市田丰生物工程公司注册成立并率先进行精液分离研究，2003年11月我国第一头性控犊牛在该公司顺利诞生。2004年，内蒙古赛科星生物科技有限责任公司、天津X Y种畜有限公司先后从美国引进精子分离设备和技术，进行奶牛性控精液的试验研究和规模化生产；与此同时，加拿大爱德牛业发展集团、深圳澳西姆畜牧生物技术有限公司(代理销售美国G R I公司的性控冻精)等也开始向全国各地供应性控冻精。目前，国内利用性控冻精人工授精生产的母犊已有数万头。 2.1 性控精液分离速度 随着人们对这一领域研究的不断深入，流式细胞仪分离技术不断改进，分离效率大幅度提高。1995年，每1000个精子通过流式细胞分离仪可产生20-40个分离纯化的精子，效率较低。Beltsville通过使用一种新的使精子定向的管嘴形成了一种高速细胞分离技术，提高了精子的分离效率。日前，利用改良的高速流式细胞分离仪，在分离准确度保持相对稳定(90％左右)的前提下，每小时可分离X、Y精子个1100万个。与20整纪90年代初每小时只能分离X和Y精子各36万个相比，提高了30多倍,精子分离速率改进的进展见下表1。 表1 精子分离速率改进的进展 年代 精子分离速率（个/秒） 1992－1997 200－300 1998－2000 1000－2000 2001－2004 3000－5000 2005－今 5000－7000 同时，流式细胞仪分离法可以获得准确度较高的单一精子。例如，1993年，Cran等用此法分离牛精子后做体外受精试验，产下3头雄犊和3头雌犊，均与预测性别相符。1998年，Abeydeem等用该法分离猪精子，X精子受精后产下23头雌性仔猪，性别准确率为97％；Y精