实验12基因表达的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测.docVIP

实验12 实验目的： 使学生掌握蛋白质电泳检测常用技术：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresisSDS），以及聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue，R-250）染色技术。同时此实验还要学生掌握如何检测分析蛋白原核表达的状态，即判断蛋白原核表达部位：培养液（medium）、可溶性胞质部分（soluble fraction）、周质部分（periplasmic fraction）、包涵体部分（insoluble fraction）。 实验原理： 聚丙烯酰胺（polyacrylamide，PAA）凝胶是丙烯酰胺（acrylamide，Acr），在交联剂甲叉双丙烯酰胺（bisacrylamide，Bis）的作用下经聚合而形成的一种大分子化合物。 图12-1 丙烯酰胺的聚合作用只有在自由基存在时才能发生，需要一个催化诱发剂系统产生自由基，过硫酸ammonium persulfate，AP′，N′-四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamineTEMED）就是这样的催化诱发系统。聚丙烯酰胺过硫酸TEMED加速聚合反应。过硫酸丙烯酰胺双丙烯酰胺诱发剂TEMED加速过硫酸形成自由基，使丙烯酰胺单体转变为自由基态。被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙烯酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。溶液的pH对聚合作用是重要的，因为过低pH没有足够的碱基加速催化反应，同样过多的氧分子存在，会使聚合作用很快停止。所以制备凝胶时，在加过硫酸之前，混合物必须抽去空气。SDS-聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于凝胶中聚丙烯酸胺的浓度和交链数量。在没有交链剂的情况下，丙烯酰胺的聚合反应形成性溶液，这种溶液是没有实际应用价值的。双丙烯酰胺形成的交链增加了凝胶的硬度和韧性，形成了DS-多混合物通过的孔。这些孔的大小随着双丙烯酰胺：丙烯酸胺比例的增加而变小，当这个比例达到约1∶时这些孔的孔径达到最小。大多数SDS聚丙烯酰胺凝胶是由一摩尔的双丙烯酰胺与29 摩尔的丙烯酰胺所组成，这是一个能够按大小分辨多而误差小于3％的经验比例。这样，凝胶的过滤性质是由孔的大小而决定的，而这些孔的大小是由加人到凝胶中的丙烯酰胺和双丙烯酰胺的绝对浓度所决定的。10~43 12 12~60 10 20~80 7.5 36~94 5.0 57~212 Bis: Acr的分子比为1∶29 图12-4 不同浓度SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离同一蛋白样品的结果 (From: ) 图12-5 浓缩胶和分离胶、上样及样品在浓缩胶中的聚集 多数情况下，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳使用一种不连续的缓冲液系统。在这一系统中，一般凝胶分为低浓度的浓缩胶（也称“堆积胶或成层胶”）和较高浓度的分离胶 （图12-5、12-6）。配制凝胶的缓冲液也有不同的pH和离子强度。在聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，在移动慢的拖尾离子（甘氨酸）和移动快的前导离子（氯）之间形成了一个界面，这是一个通常根据射系数不同而形成的可见的窄窄的条带。界面当蛋白质样品浓缩胶时，蛋白质富集在前导离子和拖尾离子之间的一个窄窄的条带中胶甘氨酸甘氨酸氯胶SDS-多胶。 图12-6 垂直电泳装置及不连续胶的位置、蛋白上样及电泳方向 SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离的蛋白质可通过考马斯亮蓝染色（Coomassie staining）或银染色（silver staining在胶上直接显示观察。一块胶可先做考马斯亮蓝染色之后再进行银染色。两种染色程序都和质谱分析兼容。或者，蛋白质可以通过电转印（electroblotting）转移到PVDF）膜上。考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝实验材料： 30%聚丙烯酰胺单体贮液： 14.55 g丙稀酰胺 + 0.45 g N，N-甲叉双丙稀酰胺，先用40ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至50 ml，0.45μm滤膜过滤。用棕色瓶储存于 4℃。 分离胶缓冲液：.5M Tris-HCl, pH8.8。 配制方法：9.08 g Tris溶解在40ml 双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值8.8，再用双蒸水加至50ml。4℃保存。 浓缩胶缓冲液：1.0M Tris-HCl, pH.8。 配制方法：6.06 g Tris溶解在40 ml双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值.8，再用双蒸水加至50 ml。4℃保存。 10 % SDS（十二烷基硫酸钠）：g SDS，用双蒸水溶解至0ml，室温保存。 10% 过硫酸：0.1 g过硫酸 1ml双蒸水。过硫酸 TEMED（