实验11植物细胞骨架的光学显微镜观察【实验目的】【实验.pdfVIP

实验 11 植物细胞骨架的光学显微镜观察 【实 验 目 的】 了解细胞骨架的结构特征及其制备技术。 【实 验 原 理】 细胞骨架 （cytoskeleton ）是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结 构可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化， 物质运输，能量转换，信息传递，基因表达的起到重要作用。当用适当浓度的 TritonX-100 处理细胞时，可将细胞质膜中和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提，但细胞骨架系统 的蛋白质不受破坏而被保存，经用戊二醛固定，考马斯亮蓝 R250 染色后，可在光学显微镜 下观察到由微丝组成的微丝束为网状结构（图 3-3 ），这就是细胞骨架。 自摄图片： 图3-3 洋葱细胞骨架 【实验仪器、材料和试剂】 （一）仪器 普通光学显微镜、50ml 烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镊子、 小剪刀、吸水纸、擦镜纸 （二）材料 洋葱鳞茎 （三）试剂 l ．M-缓冲液：50mM 咪唑、50mM KCl 、0.5mM MgCl2 、lmM EGTA ［乙二醇四乙酸］、 0.lmM EDTA 、lmM琉基乙醇或DTT （二硫苏糖醇） 2 ．6mM （pH6.8 ）磷酸缓冲液（用NaHCO3调pH ） 3 ．1%TritonX-100，用M-缓冲液配制 4 ．0.2%考马斯亮蓝 R250 ，其溶剂为：甲醇46.5ml、冰醋酸 7ml、蒸馏水46.5ml 5 ．3%戊二醛，用2 液 配 38 6 ．50%、70%、95%乙醇 7 ．叔丁醇 8．正丁醇 9 ．二甲苯 10．中性树胶 【方法与步骤】 2 l. 撕取洋葱鳞茎内表皮 （约lcm 大小若干片）置于装有pH6.8 磷酸缓冲液的 50ml烧杯 中，使其下沉。 2. 吸去磷酸缓冲液，用 l%TritonX-100 处理 20～30 分钟。 3. 吸去 Triton Ⅹ-100，用M-缓冲液洗三次，每次 10 分钟。 4. 3%戊二醛固定0.5～1 小时。 5. pH6.8 磷酸缓冲液洗三次，每次 10 分钟。 6. 0.2%考马斯亮蓝 R250 染色 20～30 分钟。 7. 用蒸馏水洗 l～2 次，细胞置于载玻片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。 8. 如观察效果好，可制作成永久切片： 在有样品的 50ml 烧杯中，顺序通过如下药物：50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、1/2 V 95% 乙醇 + 1/2 V 叔丁醇、叔丁醇 （每级5～10 分钟）；或正丁醇→正丁醇→二甲苯→二甲苯 （每 级 5～10 分钟），然后捞取样品，平展于载玻片上，经镜检，效果好的，可加一滴中性树胶， 盖上盖玻片，即成永久片。 【作 业】 1. 绘出植物细胞骨架微丝结构图。 2. 分析和论述在光学显微镜下观察到的细胞骨架的形态特征。 实验 12 细胞骨架的免疫荧光显示 Ⅰ.动物细胞微管的观察 【实 验 目 的】 1．学习用间接免疫荧光法显示动物细胞微管技术。