实验21动物细胞基因组DNA的制备-高压灭菌。.pdfVIP

生物秀-专心做生物！ 实验24 动物细胞基因组DNA 的制备 实验目的： 使学生掌握从动物细胞中制备基因组 DNA 的常用技术，以及用紫外分光光度计测定 DNA 浓度及纯度和用琼脂糖凝胶电泳法检测基因组DNA 分子量的实验技术。 实验原理： 真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组 DNA 。真核生物的 DNA 是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA 的原则是既要将DNA 与蛋白质、 脂类和糖类等分离，又要保持DNA 分子的完整。提取DNA 的一般过程是将分散好的组织 细胞在含SDS （十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K 的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异 戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA 溶液经乙醇沉淀使DNA 从溶液中析出。 蛋白酶K 的重要特性是能在SDS 和EDTA （乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活 m 性。在提取DNA 的反应体系中，SDS 可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA 分离， o EDTA 则抑制细胞中DNase 的活性；蛋白酶K 可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA 分 c 子完整地分离出来。 从核酸样品中去除蛋白质常用等体积平衡酚和氯仿：异戊醇（24 ：1）组成的混合物。 e. 其中氯仿可使蛋白质变性并有助于水相和有机相的分离，异戊醇有助于减少抽提过程中泡沫 的形成。平衡酚的pH 应在7.8 以上，否则DNA 会进入有机相。 7 o 本方法一般可从5 ×10 培养的非整倍体细胞（如HeLa 细胞）中获得大约200μg DNA 。 DNA 的长度可达到100~150kb。20ml 正常血的DNA 产量约为250μg 。 i 实验试剂： [1]. PBS 溶液：137mM NaCl，2.7mM KCl ，10mM Na HPO ，2mM KH PO 。配制： 2 4 2 4 b e HPO ·12H O，0.24g KH PO ；用 用800ml 水溶解8g NaCl，0.2g KCl，3.22g Na2 4 2 2 4 HCl 将pH 调至7.4 ；定容至1000 ml。高压灭菌或过滤除菌，室温保存。 . [2]. STE 溶液：0.15 M NaCl，10 mM Tris-HCl （pH 8.0 ），1mM EDTA （pH 8.0 ）。 物 高压灭菌。 w [3]. 20% SDS ：900ml 水溶解200g 电泳级SDS。加热到68°C 并用磁力搅拌器搅拌助 生 溶。如果需要，加几滴浓HCl 调解pH 为7.2 。用水定容到1000ml。室温保存， 易 w 无须灭菌。 [4]. 蛋白酶K 溶液（20mg/ml ）：20mg 蛋白酶K 溶于1ml 灭菌ddH2O 中，分装-20℃