柱前衍生化高效液相色谱等度洗脱分析单糖的方法建立.pdfVIP

维普资讯 研究论文 生命科学仪器 2005第3卷／第2期 柱前衍生化高效液相色谱等度洗脱分析单糖的方法建立 徐瑾 ～，李彤 ，张庆合 ，张维冰 (1．中国科学院大连化学物理研究所，辽宁大连 116011；2．常州工程职业技术学院，江苏常州I213164) 摘要 以1一苯基一3一甲基一5一吡唑啉酮 (PMP)为柱前衍生化试剂，建立了高效液相色谱等度洗脱分离分析5种单糖的 方法。采用简化的衍生化方法，在流动相：乙睛一醋酸盐缓冲液 (0．In~ol／L，pH=5．5，V／V=22：78)的色i酱分离条件下，5种 单糖衍生物可以达到基线分离，检测限分别为0．54～0．90ng，也对方法的线性范围、精密度、稳定性进仃lr系统的杉察 关键词 单糖，1一苯基一3一甲基一5一吡唑啉酮 衍生化，高效液相色谱，等度洗脱 1 前言 UV200Ⅱ紫外可变波长检测器 P200Ⅱ高压恒流 Eclwom98工作站 (大连依利特科学仪器有限公司)；真 近年来，糖类物质在生物学领域的作用已越来越 空过滤器 (天津市腾达过滤器件厂)；H19321pH计 被重视，人们将研究的重点放在糖类物质的定量、定 (HANNA)；DZF一150型数显小型恒温真空干燥箱 (郑州 性以及结构分析上，并对此做了大量的研究。因为糖 长城科工贸有限公司)。 的种类较多，且结构近似，所以无论对哪种糖进行分 2、2 试剂 析，首先必须将分析的对象与其它糖分离开来：另一 乙腈、甲醇 (色谱纯)；三氯甲烷、乙酸铵、氢氧化 方面糖类物质几乎没有光学活性，对分离后的物质进 钠 (分析纯)；PMP(99％，ACROS)；D一半乳糖、D一木 行直接光学检测比较困难，结合灵敏度、选择性等方 糖、鼠李糖(生化试剂)；葡萄糖、D—I十露糖 (分析纯)。 面的问题，人们多采用通过化学标记将糖类物质转变 2．3 单糖 一PMP衍生产物的制备 为具有光学活性的物质，然后再进行分离分析的方法。 以葡萄糖 (Glucose)为例，将1otol的Glucose溶于 衍生方法与高效液相色谱 (HPLC)结合使用不但能提 1．5mL的NaOH溶液 (0．3mo~L)中，取该溶液 150 L 高检测的灵敏度，而且可以改善分离特性。迄今为止， 与 100 L的PMP／甲醇溶液(0．5mol／L)~~合，在70~C下 文献报道的用于糖类物质衍生的紫外衍生试剂种类很 反应30min。取出后冷却至室温，然后加入150 L的 多[1-3]，它们都各有优缺点。近年来出现的1一苯基一3一 HCl(0-3otol／L)进行中和，中和后的溶液放入真空干燥 甲基一5一吡唑啉酮(PMP)是一种具有强紫外吸收的衍生 箱中，100~C下烘干。烘干后的物质用2mL的水及2mL 试剂，Honda等4[J发现该试剂可以与还原性的糖在温和 的氯仿溶解，充分振荡后除去有机相，萃取过程重复3 条件下反应，无需酸催化，不会引起脱 甲硅基的作用， 次 水相溶液经0．45 m的滤膜过滤后，用水稀释至 产物无立体