第二节实际蛋白样品的提取、酶解及前处理.pdfVIP

第二章蛋白的酶解条件及实际蛋白样品的处理 第二节 实际蛋白样品的提取、酶解及前处理 蛋白的提取、酶解在整个样品的分离鉴定中占有很重要的位置。目前蛋白分 步提取的方法[661主要是针对二维凝胶电泳，它的提取液中含有高浓度的解聚剂、 表面活性剂，它们的存在会降低溶液酶解的效率，有些物质对后续的色谱分离、 质谱鉴定还有影响，因此，本文结合第一节溶液酶解的实验结果与现有的分步提 取方法，希望能找出一条适合溶液酶解的提取步骤。 样品的前处理也相当重要。它对样品的分离结果能有所改善，本文主要是针 对两种比较常用的方法 (固相萃取除盐和微量过滤膜除大分子)进行了些讨论。 1.实验部分 1.1实验仪器和试剂 HP1100毛细管液相色谱二元泵 (安捷伦公司)，六通阀(7725,Rheodyne), Esquire3000电喷雾离子阱质谱仪 (Bruker公司，德国)。 反相色谱柱(ZORBAX300SB,0.3x150mm,3.51rm)购自安捷伦公司。1mL 固相萃取柱 (BioSelect218SPE,RPC18)购自竹dac公司。MicroconYM-3(微 量过滤膜)购自Millipore公司。 肌红蛋白(Myoglobin，马心)、胰蛋白酶 (trypsin，非测序级)购自Sigma 公司，甲醇 (MeOH,HPLC级)、乙睛 (ACN,HPLC级)购自Merck公司，甲 酸 (FA,99%)购自Acros公司，碳酸氢按购自上海化学分析试剂有限公司，二 硫代苏糖醇 ((1,4-Dithiothreitol,DTT)和尿素 (Urea)购自上海博光生物科技有 限公司。碘乙酞胺 (IAA)购自Fluka公司，PMSF购自上海华舜生物工程有限 公司，SDS(Sodiumn-DodecylSulfate)购自CALBIOCHEM 公司，ALS (RapiGestTMSF)购自Water:公司。 1.2蛋白的提取 从大鼠肝脏中取一定量的组织，用PBS清洗3次，将血洗干净后，然后剪 碎，放入玻璃匀浆器中，加入少量提取液1(40mMTris,5mMDTT,0.2mM PMSF,ImMEDTA,pH=8)，匀浆后，将溶液转入试管内，按照组织的湿重， 再加入一定量的提取液1，混旋30min，然后离心30min，转速12000g，取上 清液El，-80℃保存备用 将下面沉淀的蛋白用提取液 1清洗2遍，然后再加入提取液 2(50mM NH4HCO3,7MUrea,2Mthiourea),混旋30min，其余步骤同上，得溶液Ego 最后加入0.5%ALS(含50mmNH4HC03)来溶解试管底部的白色不溶物， 第二章蛋白的酶解条件及实际蛋白样品的处理 此乃E3. 以上操作均在冰浴上进行。 1.3蛋白的酶解 在组分El中加入Urea，使得其浓度为8M,然后加入DTT将蛋白二硫键 打开，再加入IAA作烷基化，最后用50mMNH4HC饥稀释4倍，按底物/酶质 量比为50/1加入胰蛋白酶，370C酶解过夜。. 组分E2直接先将蛋白还原烷基化，然后用50mMNH4HC饥稀释4倍，加 入一定量胰蛋白酶，370C酶解过夜。 在组分E3中加入50mMNH4HCO3将ALS的浓度稀释到0.1%，然后将蛋 白还原烷基化，加入一定量胰蛋白酶,370C酶解过夜。酶解完后加入550mMHCl (加入的体积为样品体积的1/10)将样品酸化，然后37℃恒温反应45min，将 样品取出离心 ((13,000rpm)10min，取上清液保存。 1.4固相萃取 固相萃取柱的使用和ziptip一样，首先用1ml乙睛将填料活化，然后再加入 Iml0.1%FA水溶液平衡色谱柱，样品上样，1mlSPE的肤段柱容量为0.5-0.75 mg，待肤段都被吸附在SPE柱上以后，加入一定量的0.1%oFA水溶液将盐从SPE 柱上冲洗下来，然后加入洗脱溶液，200闪0.1%FA-50%ACN的水溶液和100闪 0.1%FA-80%ACN溶液，将肤段从反相填料上洗脱下来。通过在SPE柱上加压 来控制溶液的流速。 I.活化平衡 2.上样 3.除盐 4.洗脱