二氟化硼二吡咯甲烷BODIPY类荧光试剂柱前衍生高效液相色谱分离荧光检测磷酸化氨基酸.pdfVIP

2013年5月 中央民族大学学报(自然科学版) May，2013 of Sciences V01．22NO．2 第22卷第2期 Journal MUC(NaturalEdition) 二氟化硼一二吡咯甲烷(BODIPY)类荧光 试剂柱前衍生高效液相色谱分离 荧光检测磷酸化氨基酸 李金淑1”，张华山2，王 红2 (1．中央民族大学生命与环境科学学院，北京100081 2．武汉大学化学与分子科学学院，武汉430072) 摘要：建立了采用新型荧光试剂1，3，5，7-四甲基．8．苯基一(4-O一(N一琥珀酰亚胺乙酸酯))一二氟化硼一二吡 咯甲烷(TMPAB-OSu)为衍生化试剂的柱前衍生高效液相色谱分离荧光检测分析方法测定三种磷酸化氨基 酸．在最佳的实验条件下，方法测定磷酸化丝氨酸(P．Ser)、磷酸化酪氨酸(P．Tyr)、磷酸化苏氨酸(P-Thr)的线 X 性范围为0．05—2．510一mol／L；检出限为2×10一mol／L． 关键词： 高效液相色谱；二氟化硼．二毗咯甲烷(BODIPY)；荧光检测；磷酸化氨基酸 中图分类号：0643．13文献标识码：A 文章编号：1005—8036(2013)02-0023-05 蛋白质磷酸化作用是通过对蛋白质上的氨基酸进行磷酸盐的酯化作用来改变蛋白质构象，进而影 响蛋白质的活性和稳定性，在许多生物化学过程如细胞外信号的传递以及细胞内调整代谢中起着关键 性的调节作用u。．因此测定磷酸化蛋白以及磷酸化氨基酸对于研究细胞生物学和生物医学具有十分重 要的意义‘21． 经典的检测磷酸化过程的方法是采用放射性同位素32P射线自显迹法∞1，但该方法需要的大量放 射性同位素32P具有一定的危害性．测定磷酸化氨基酸的方法还有酶分析法Hj、色谱法¨“J、免疫分析 法‘71和质谱法¨1等．其中通过引入荧光团作为分子标记的荧光衍生法可以大大提高方法的灵敏度． 本文报道采用新型荧光试剂1，3，5，7一四甲基．8．苯基．(4’．O．(N．琥珀酰亚胺乙酸酯))一二氟化硼-二 吡咯甲烷(TMPAB-OSu)，建立了高效液相色谱分离．荧光检测磷酸化氨基酸的分析方法．该法的线性范 X 围为0．05—2．5 1 仪器与材料 1．1仪器与试剂 收稿日期：2013-01—25 年教师科研基金(No．MZ2008033)；中央民族大学“985工程”资助项目(No．MUC985)． 作者简介：李金淑(1978一)，女(汉族)，湖南衡阳人，中央民族大学生命与环境科学学院副教授，主要从事分子探针 与检测试剂的研究． 万方数据 24 中央民族大学学报(自然科学版) 第22卷 通阀(20斗L)、荧光检测器，由化学工作站软件控制各组件的运行；ZORBAXEclipseXDB—C。分析柱(150 ×4．6mm，5 ToledoDELTA320 lxm，美国)；Mettler pH计． 酸、磷酸、醋酸钠、氢氧化钠、乙腈、甲醇、四氢呋喃、五氧化二磷(分析纯，上海试剂公司)；TMPAB— OSu—o(本实验室合成，2×10‘3mol／L水乙腈溶液)；实验用水为二次蒸馏水． 1．2色谱条件 流动相由甲醇和水溶液配制，进样前，C。分析柱用流动相平衡30min，样品进样量为20斗L，流速为 1．0 =497／509nm． mL／min，柱温为室温，荧光激发及发射波长为：A。…／A