PCRTag荧光技术在检测鲍曼不动杆菌中的初步应用.pdfVIP

第45卷第1期 郑州大学学报(理学版) V01．45No．1 2013年3月 Univ．(Nat．Sci．Ed．) Mar．2013 J．Zhengzhou PCR-Tag荧光技术在检测鲍曼 不动杆菌中的初步应用 张晓千， 时文化， 史团省， 赵万千 (郑州大学生物工程系 河南郑州450001) 摘要：建立一种自动化、高通量化的PCR产物鉴定方法并应用于临检实验室．对临床分离后经过生化反应鉴定的 208例鲍曼不动杆菌，运用PCR．Tag(尾标)荧光技术进行检测分析，阳性率达到92％，与同等条件下所进行的普通 高可靠性的现代临床分子检测技术的要求，符合临床分子细菌学快速检测的发展方向． 关键词：PCR—Tag荧光；PCR；鲍曼不动杆菌 中图分类号：Q31 文献标志码：A 文章编号：1671—6841(2013)01—0090—05 DOI：10．3969／j．issn／1671—6841．2013．01．022 0 引言 建立现代化的临床分子微生物实验室依赖自动化、高通量、高度可靠性的分子检测方法，这些方法又建 立在敏感、特异、成熟的临床生物化学检验技术和相应配套的高度自动化的分析仪器之上．目前，在临床分子 检测中最敏感、最特异且成熟的技术是PCR及其衍生技术．但是，常用的检测PCR产物的技术是琼脂糖凝 胶电泳，具体步骤上要求手工操作和目视判定结果；在检测大批量样品时，无法进行自动化分析．该技术在打 开反应管取出产物的操作过程中和随后的电泳过程中，DNA产物直接暴露于试管外，增加了形成“产物DNA 气溶胶”污染物的机会，造成检测仪器内部环境或实验室环境的持续污染，所以PCR一凝胶电泳技术不符合 临床实验技术发展方向的要求…．近年来临床采用的荧光定量PCR技术，在基础科研和临床实验检测中得 到广泛应用，但缺点是必须使用荧光定量PCR仪．该仪器价格高，增加了检测成本拉J．总之，由于产物检出方 法的限制，PCR法在I临床应用中优势尚不能得到充分发挥． 常见的恒温扩增技术，如链置换扩增技术13 J、junctionprobe【4 术．PCR是分子生物学中公认的黄金方法．为了能使PCR技术在自动分析型仪器上成功运行，本研究在PCR 技术的基础上，参考链置换扩增技术原理设计引物，在引物的5’端加入尾标修饰部分(Tag)，通过探索建立 J． 序列和荧光信号的放大强度来判定结果∞‘9 能产生Tag的反义链，这就避免潜在的假阳性和背景值；此外，利用不对称PCR总反应以产生单链为主的特 点，结合了两种方法的优点，通过促进Tag反义链的产生，提高了beacon分子与扩增靶标结合的效率；而最 大的特点是在操作过程中，不需从反应管中取出反应液体，避免了PCR产物的外向型暴露，从而减少了实验 室核酸超级污染的机会．为验证PCR—Tag法的可靠性，选用广泛存在于自然界的水及土壤、医院环境及人体 皮肤、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，经常引起医源性感染的且造成极高死亡率的鲍曼不动杆菌(Acineto． 收稿日期：2012一01—09 主要从事生物医学及诊断学研究，E-mail：wqzha050@hotmail．com． 万方数据 第1期 张晓千，等：PCR—Tag荧光技术在检测鲍曼不动杆菌中的初步应用 91 bacter 分子快速检测技术的途径． 1材料与方法 1．1材料 采集，经APl20NE检测鉴定． 1．1．2主要试剂与仪器琼脂培养基，PCRMix，DNAmarker，GoldViewI核酸染色剂购自东盛生物公司， Nt．Bbvc I购自NEB公司，PCR仪、电泳仪，凝胶图像系统购自Bio—Rad公司，恒温培养箱，TriStarLB941微孔 板式多功能分析仪购自Berthold Technologies公司． 1．2方法 1．2．1细菌的培养将鲍曼不动杆菌接种到