梅花鹿生茸区骨膜干细胞 cDNA 表达文库的构建.pdfVIP

梅花鹿生茸区骨膜干细胞cDNA 表达文库的构建 1,2 2 2 2 2 鲁晓萍 赵海平 杨福合 邢秀梅 李春义 * (1.江苏科技大学生物与环境工程学院 镇江 212018 ；2. 中国农业科学院特产研究所吉林省 特种经济动物分子生物学省部共建实验室 特种经济动物种质资源遗传改良重点开放实验室 吉林 132109 ；） Construction of cDNA Expression Library of Antlerogenic Stem Cells in Sika Deer (Cervus nippon Temminck) 1,2 2 2 2 2 LU Xiao-ping ZHAO Hai-ping YANG Fu-he XING Xiu-mei LI Chun-yi ※ (1. Biotechnology College of Jiangsu University of Science and Technology Zhenjiang 212018; 2.Institute of Special Wild Economic Animal and Plant Science, CAAS, Jilin 132109) 摘要：本研究提取鹿生茸区骨膜干细胞 RNA，进而纯化mRNA，利用Oligo(dT)引物反转录合 成双链 cDNA，然后在其两端加EcoR Ⅰ∕HindⅢ定向接头并酶切，将 cDNA 分子定向连接到具 有 EcoR Ⅰ∕HindⅢ粘性末端的λSCREEN 载体中，经过柱分级分离后，体外包装成初级文库， 进行文库库容量测定和扩增，初级文库库容量约为 1.5 ×106pfu ∕毫升。PCR 检测 cDNA 文库 的质量表明，插入片段均分布在 300bp 以上。因此，我们认为我们已在鹿茸的研究史上成功 地构建了梅花鹿鹿生茸区骨膜干细胞的 cDNA 文库，为进一步开展鹿茸发育的分子生物学研 究奠定了基础。 关键词：鹿生茸区骨膜；cDNA 表达文库；库容； 鹿茸是雄鹿额部生长出来的尚未骨化的嫩角，是雄鹿的第二性征，具有较大的药用价值。 鹿茸还是唯一的失去后还能完全再生的哺乳动物器官，它每天能生长 1～2 厘米，为哺乳动 物生长最快的组织。但这一组织并不出现癌变的象征，可以作为很好的器官再生研究模型。 搞清楚鹿茸再生机制，将为动物组织器官再生提供可借鉴的理论依据。研究证实鹿茸的再生 来源于角柄骨膜干细胞，生茸区骨膜细胞层细胞是角柄组织发生所依赖的干细胞，角柄中不 同阶段的软骨及骨细胞都来源于这一细胞层的细胞，生茸区骨膜干细胞在鹿茸的再生过程中 具有不可替代的作用。换句话说，鹿茸的完全再生过程是一个由鹿茸干细胞所驱动的过程。 因此，研究生茸区骨膜细胞层细胞对于研究鹿茸再生机制具有重要的意义。但是目前为止， 鹿茸神奇的药用价值及其再生机制依然是一个谜，人们对鹿茸的研究还基本停留在形态、组 织、至多在细胞水平上，对鹿茸基因方面的研究仅处于初级阶段．随着分子生物学技术的发 展及其表现出的强大优势，不少研究者把目标放在了有关鹿茸基因方面的研究。本文利用分 子生物学技术成功地构建了梅花鹿生茸区骨膜细胞 cDNA 表达文库，为下一步寻找克隆有 关鹿茸再生的新基因打下了基础。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 细胞 鹿生茸区骨膜细胞:本实验室取材培养 1.1.2 主要试剂 DEPC(SIGMA); Trizol Reagent (Invitrogen); mRNA Purification kit (Amersham); Orient Express cDNA Library Construction Systems (λSCREEN; Novagen); DNA Marker (DL2000; TaKaRa), SM （per liter: 20 毫升 5 摩尔/升 NaCl,10 毫升 1 摩尔/升MgSO4,50 毫升 1 摩尔/ 升Tris-HCl (pH=7.5) ）, 其余试剂均为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 鹿生茸区骨膜取材方法 选