海带（Laminariajaponica）种质分离,培养和应用的技术操.docVIP

海带(Laminaria japonica)种质分离，培养和应用的技术操作规范 中国科学院海洋研究所海洋生物种质库 联系人： 逄少军博士，费修绠教授 电话：0532-2868831 email:sjpang@ website: 中国青岛市南海路7号，266071 内容目录 海带的生物学特征，生活史------------------------1 海带的地理分布，自然生活环境--------------------2 海带养殖的简短历史------------------------------3 海带种质的分离技术------------------------------4 海带种质的长期保存技术--------------------------5 海带种质的丰富培养技术--------------------------6 海带种质的复苏技术------------------------------7 海带种质在种苗培育和杂交育种上应用技术----------8 中国科学院海洋研究所海洋生物种质库保存的不同物种海带品系目录和可以提供的技术服务种类--------------9 海带的生物学特征，生活史 海带(Laminaria japonica)隶属于褐藻门(Phaeophyta)，褐藻纲(Phaeophyceae)，海带目(Laminariales)，海带科(Laminariaceae)，海带属(Laminaria)，是一种多年生的、生活在潮下带2-20米水深的冷水性大型褐藻，长成的海藻长度2-6米，取决于生长环境。海带自然分布在俄罗斯太平洋沿海，日本，朝鲜半岛海岸和中国北部沿海。海带具有明显的异型世代交替的生活史，由显微的单倍雌雄配子体和双倍的大型孢子体组成。海带的孢子囊在长日的晚春-早夏形成，带双鞭毛的游孢子从孢子囊中释放后，在附着基上附着和萌发形成单倍的配子体，并以配子体形式渡过夏季的高水温期。秋天当水温下降到18oC以下后，配子体完成发育，雌配子体排出的卵子受精形成孢子体。孢子体的营养生长（长度和重量的增长）主要在冬季的低水温期（5-15oC）完成。海带的异型世代交替生活史见图1。 图1 海带的异型世代交替生活史是由孢子体，雌雄配子体组成。 海带养殖的简短历史 海带除了可以作为人的食品直接食用以外，还是动物饲料工业，藻胶工业，食品工业，医药工业的重要原材料，因而，长期以来一直是我国重要的水产增养殖的水产品种类，主要的养殖基地在我国的辽宁，山东，江苏，福建等地。我国海带养殖有50多年的历史，海带的养殖规模和产量长期位居世界首位，总产量达到70万吨干品以上。海带的人工养殖分人工育苗和海上养成两个阶段。人工育苗采用低温（10oC）渡夏的方法，在每年的7-8月将成熟的海带种菜阴干并大量释放游孢子，释放的游孢子附着在用棕绳编制的苗帘上，利用自然光并根据幼苗的生长阶段进行适当的调整，进行全人工育苗。整个育苗过程历时3个月，全程采用人工降温的海水。当海面的水温下降到适宜于幼孢子体生长的范围后，幼苗被转移到海上暂养，并完成分苗养殖。 海带种质的分离技术 海带的种质保存主要是指保存单倍的雌雄配子体。在低温、低光的条件下，使用煮沸或者高压消毒的天然海水，添加营养盐来进行长期培养和保存。早在上个世纪初，欧洲的海藻学家就观察和报道了海带类褐藻的单倍配子体的形态特征和在一定条件下只进行营养生长形成丝状体的规律。由于大型双倍的孢子体的实验室的培养和保存需要复杂的条件，同时也存在许多限制生长的因子，因而在生产和科研中，主要以保存配子体的方式来保存海带的种质。而大型孢子体的获得主要是通过来年的海上养殖来获得。从理论上讲，由于海带类单倍体配子体细胞的营养生长和增生是通过细胞有丝分裂完成的，不经过减数分裂的过程，因而增生的配子体不存在形状分化问题。这样，后代的孢子体的性状就不会发生变异。 图2是海带的种质分离过程的简图。首先是选择成熟良好的海带种菜，用消毒海水冲洗后，用纱布对表面进行反复擦拭，除掉表面的附生杂藻，低温阴干24小时后，放置到消毒的低温海水中，放散游孢子。用消毒海水稀释游孢子溶液到每视野1-2个孢子的水平（X100倍）。将1毫升的稀释液转移到9厘米培养皿中，加入10毫升PES培养液，在12小时光照，低温海水，1000lux条件下培养12天。之后，将光照强度降低到10倍，培养20天。之后在20倍显微镜下，用消毒的玻璃毛细管，将初长成的雌雄单倍体克隆逐个分出，分别培养在50毫升的消毒三角瓶。 图2 海带单细胞单倍体克隆种质分离的技术流程 海带种质的丰富培养技术 图3是海带单倍体种质丰富培养的技术操作流程。将保存在50毫升三角瓶中的雌雄单倍体克隆无污染粉碎成丝状体，扩大培养至500毫升