9148001130样品的处理及目的蛋白的SDS-PAGE电泳.pdfVIP

浙江省第五届大学生生命科学学科竞赛 实验记录 序号： 44   实验时间： 9 月 14 日  8:00    －   11:30 请勿透露学校、教师和个人信息  样品的处理及目的蛋白的 SDS电泳 一、 实验原理 SDS电泳技术首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。当在样品介质和聚 丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS后，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，其它因素可以 忽略不计。 SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键。在强还原剂 如巯基乙醇或二硫苏糖醇的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子 与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电 荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异，蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆 棒。椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基-SDS复合物基本上是相同的（约18μm），但长轴的长度则与蛋白 质分子量的大小成正比，因此这种复合物在SDS系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响， 而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质及其亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15-200kD之间时， 电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDS不仅可以分离鉴定蛋白质，而且可以根据迁 移率大小测定蛋白质亚基的分子量。 二、实验材料 实验试剂：SDS蛋白上样缓冲液、ddH2O、5X蛋白缓冲液等。 实验器材：超声波细胞粉碎机、离心机、微量加量枪、超净台等、迷你型蛋白垂直电泳槽等。 其他：梳子、枪头、PET28b-BL21菌液、PET28b-Rosetta菌液、PET24a-BL21菌液PET24a-Rosetta菌液等。 三、实验步骤 1．样品的处理 1.1将过夜培养的菌液加入EP管离心1min，12000g。弃上清。 1.2 重复步骤1.1直至菌液用完。 1.3 将每支EP管都加入1ml的ddH2O并将其搅匀。 1.4 取40ul菌液，加入5X SDS蛋白上样缓冲液10ul，重悬，混匀。 1.5 混匀后，放入沸水中煮沸10min。 2.目的蛋白的SDS电泳 2.1 取出已经制备好的 SDS电泳胶，并装好电泳系统，加入 1X 蛋白电泳缓冲液。 2.2 上样顺序 1 诱导BL21，2 诱导ADI-BL21，3 诱导 ACR-BL21，4 Rosetta诱导，5 诱导 ADI-R， 6 诱导 ACR-R。 2.3 连接电源，先用 30V 恒压电泳，当漠酚蓝从浓缩胶进入分离胶时，将电压调至 90V，继续电泳直至 澳酚蓝距凝胶底部停止电泳。 2.4 关闭电源，小心取出凝胶，浸泡在盛有考马斯亮蓝 R250 染液的容器中，染色 30min。 2.5 倒去染色液，将凝胶在蒸馏水中漂洗数次。再加入脱色液反复脱色至获得清晰蓝色条带及干净背景。 2.6 凝胶拍照。   四、实验结果  在隔夜培养过程中，由于漩涡振荡器培养出现故障，转速只有 60rpm,导致细菌生长缓慢，菌液较清澈。 浙江省第五届大学生生命科学学科竞赛 实验记录 序号： 44   实验时间： 9 月 14 日  8:00    －   11:30 请勿透露学校、教师和个人信息  故本次蛋白电泳中，仅观察了全菌的蛋白表达情况。 图 1 为全菌蛋白电泳图谱， 相对于 BL21 和 Rosetta 这两个宿主菌的蛋白表达情况，重组菌均有 ADI 的表达，但是量比较少。由于菌液生长情况不好，本次实验需要重做。                                    图 1 菌液蛋白电泳图谱 1：诱导BL21 2： 诱导 ADI-BL21 3： 诱导ACR-BL21 4： Rosetta 诱导 5： 诱导ADI-R 6： 诱导 ACR-R