人胶质细胞源性神经营养因子基因修饰猴雪旺细胞的构建与鉴定.pdfVIP

2013 11 27 11 中国修复重建外科杂志 年 月第 卷第 期 1363 · · • 干细胞与组织工程• 人胶质细胞源性神经营养因子基因修饰 猴雪旺细胞的构建与鉴定 巴越洋 王辉 宁昕杰 【摘  要】    目的  构建人胶质细胞源性神经营养因子（human glial cell derived neurotrophic factor ，hGDNF ）基因 修饰的猴雪旺细胞稳定细胞系。  方法  以pUC19-hGDNF 为模板，扩增含hGDNF 基因序列，将其插入质粒pBABE- puro ，构建pBABE-puro-hGDNF 重组真核表达载体，经酶切鉴定及DNA 测序鉴定重组质粒。从恒河猴提取、培养、纯化雪 旺细胞。包装病毒，利用含hGDNF 基因的重组逆转录病毒转染雪旺细胞，实时荧光定量PCR 、Western blot 检测hGDNF mRNA 及蛋白表达情况。  结果 PCR 产物hGDNF 基因编码序列大小约596 bp 。重组表达载体经双酶切鉴定，含 有 1 条596 bp 的特异性条带，其基因测序结果与基因库中hGDNF 基因序列片段相同，提示hGDNF 基因成功转入逆转 录病毒。逆转录病毒转染的雪旺细胞hGDNF mRNA 及蛋白表达量显著高于未转染雪旺细胞，差异有统计学意义（P 0.05 ）。  结论  成功构建hGDNF 基因修饰的猴雪旺细胞稳定细胞系，能长期稳定高效释放hGDNF ，为进一步将其应用 于神经损伤修复奠定了基础。 【关键词】    人胶质源性神经营养因子    重组逆转录病毒    基因转染    雪旺细胞    恒河猴 CONSTRUCTION AND IDENTIFICATION OF RHESUS MONKEY Schwann CELLS MODIFIED WITH HUMAN GLIAL CELL DERIVED NEUROTROPHIC FACTOR GENE/BA Yueyang, WANG Hui, NING Xinjie. Department of Neurosurgery, the Third Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou Guangdong, 510630, P.R.China. Corresponding author: WANG Hui, E-mail: doctorwanghui@126.com 【Abstract 】 Objective To construct the rhesus monkey Schwann cells (SCs) modified with human glial cell derived neurotrophic factor (hGDNF) gene. Methods The coding sequence of hGDNF amplified by PCR from pUC19-hGDNF was inserted into eukaryotic expression vector pBABE-puro. The recombinant eukaryotic expression vector pBABE-puro-hGDNF was identified with restriction enzyme digest