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实验九 植物DNA 的提取 实验内容 采用CTAB 法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析和琼脂糖凝胶电泳。 目的要求 掌握CTAB 法从植物叶片提取DNA 的原理和方法。 实验原理 1、原理 核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的 形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中,前者主要 存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和 细胞膜，使核蛋白被释放出来。 在浓氯化钠溶液(1～2mol ／L)中，DNA 核蛋白的溶解度很大，RNA 核蛋白的溶解度很 小；而在稀氯化钠溶液(0.14mol ／L)中，DNA 核蛋白的溶解度很小，RNA 核蛋白的溶解度很 大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA 核蛋白和RNA 核蛋白从样品中分别抽提出 来。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3 种：① 用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白 质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA 溶于上层水相。用两倍体积95 ％乙醇溶液将DNA 钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA 。②用十二烷基硫酸 钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA 。③用苯酚处 理，然后离心分层，DNA 或溶于上层水相，或存在于中间残留物中，蛋白变性后则停留在酚 层内。吸出上面水层，将其注入两倍体积的95 ％乙醇溶液中，得到白色纤维状DNA 沉淀。 反复使用上述方法多次处理DNA 核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯 的DNA 制品。为了彻底除去DNA 制品中混杂的RNA，可用RNA 酶处理。生物材料中含有 的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。 在DNA 提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因 素，核酸的结构在pH 值4.0—11.0 间较稳定，pH 值在此范围外就会使核酸变性降解，故制 备过程应避免过酸过碱。②物理因素，DNA 分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性。 又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA 分子断裂，不利于收集，应加以避免。 ③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA 分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。常用的 酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。SDS 和苯酚作为 蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。 2、DNA 的提取原理 （1）CTAB 法是一种快速简便的提取植物总DNA 的方法：先将新鲜的叶片在液氮中研磨， 破碎其细胞，然后加入CTAB 分离缓冲液，将DNA 溶解出来，再经氯仿-异戊醇抽提除去蛋 白质，最后得到DNA 。 （2 ）SDS 法是植物总DNA 的提取方法。先将新鲜的叶片在液氮中研磨以机械力破本碎细胞 壁，然后加入SDS 使细胞膜破裂，并同时将蛋白质和多糖等杂质与核酸分开。加入KAc 可 使SDS—蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式，使沉淀更加完全。 3、DNA 的浓度测定和纯度分析 （1）定磷法：是对样品中核酸（DNA 和RNA ）含量的准确定量。将样品中的核酸用强酸（硫 酸或高氯酸）消化成无机磷，然后用定磷试剂对生成的无机磷酸进行滴定。定磷试剂是酸性 钼酸铵溶液，钼酸铵能与无机磷酸定量结合成磷钼酸络合物，该络合物能被抗坏血酸等还原 剂还原成兰色的钼蓝，在660nm 处有最大光吸收。 （2 ）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在 260nm 。1ug/mL的DNA 溶液 A260=0.020，1ug/mL的RNA溶液或单链DNA的A260=0.022~0.024 。1 个A260相当于 50ug/mL的 DNA，40ug/mL的RNA 。蛋白质的最大吸收在280nm，多糖的最大吸收在230nm 。纯的DNA 的A260/A280在1.8 左右，