BiP表达下调改善双载体转断裂FⅧ基因的功效.pdfVIP

ISSN 1007—7626 中国生物化学与分子生物学报 http：／／cjbmb．bjmu．edu．ca 2011年 l2月 CN 11-3870／Q ChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiology 27(12)：1161～l166 · 技术与方法 · BiP表达下调改善双载体转断裂 F聊基因的功效 朱甫祥 ，刘泽隆，缪 静，屈慧鸽，迟晓艳 (鲁东大学生命科学学院，山东烟台 264025) 摘要 双载体转凝血Ⅷ 因子 (FⅧ)基 因可作为一种转基因策略克服腺相关病毒 (AAV)载体容量 限 制 ，但重链分泌的低效性影响转基 因功效．为提 高重链分泌，本文用 RNA干扰技术下调 内质网内 蛋白伴侣分子免疫球蛋 白重链结合蛋 白(BiP)的表达，观察对 HEK293细胞双载体共转 FIⅢ基因 分泌重链和生物活性 的影响．结果显示 ，RNA干扰可 明显下调 BiP表达，但不影响细胞生长； ELISA检测 BiP下调细胞单独转重链基因时的重链分泌量为 98±38ng／mL，与轻链共转基 因时显 著升高到 157±32ng／mL，明显高于对照细胞单独转重链基 因和共转重链和轻链基 因的重链分泌 量 (分别为 29±8ng／mL和 794-19ng／mL)；Cotest法检测显示 ，BiP下调细胞共转重链和轻链基 因 细胞分泌的凝血生物活性为 0．73±0．23IU／mL，明显高于对照细胞共转重链和轻链基 因(0．39± 0．07IU／mL)．结果表明，BiP表达下调通过促进重链分泌 ，可提高双栽体共转 FⅧ基 因的功效 ，为 进一步动物体 内双 AAV载体转 FⅧ基因的甲型血友病基 因治疗研 究提供 了实验依据． 关键词 凝血Ⅷ因子；双载体转基 因；免疫球蛋 白重链结合蛋 白；重链分泌 中图分类号 Q78 DownRegulatedBiP Expression ImprovesEffi cacyof SplitF V／／／GeneDeliverybyaDual-Vector ZHUFu—Xiang ，LIUZe—Long，MIAOJing，QuHui—Ge，CHIXiao-Yan (Collegeof Sciences，LudongUniversity，Yantai 264025，Shandong，China) Abstract Dua1．vectortransferofcoagulation factorⅧ (FⅧ ) genehasbeen developpedasan alternativestrategytoovercomethepackaginglimitationofadeno-associatedvirus(AAV)vectorsbutits efficacywasadverselyaffectedbyaniBefficientheavychainsecretion．Inthisstudy．weaimedtoimprove secretionofFvm heavy chain by down—regulatingexpressionofimmunoglobulin heavy—chain binding protein(BiP)，anERchaperonproteinwithRNAitechnology，andobservedsecretedheavychainandF Ⅷ bioactivitybyHEK293cellsafteradua1．vectorco．tranductionwithsplitFⅧ gene．Thedatashowed thatRNA interferencecouldobviouslydown．regulatetheexpressionofBiPbutnoeffectwasofundoncell proliferation．Itshowed much higherlevelsofheavycha