Hela细胞对阳离子脂质体／DNA复合体的摄取机制.pdfVIP

中国细胞生物学学报 ChineseJournalofCellBiology2011，33(12)：1331-1335 http：／w／ww．cjcb．org Helafl~胞对阳离子脂质体／DNA复合体的摄取机制 丁会芹，。崔韶晖 王 冰 洪 洋 张树彪 木 (中国医科大学基础医学院，沈阳 110001；大连民族学院生命科学院国家民委一教育部重点实验室，大连 116600) 摘要 该文主要研究了Hela细胞对阳离子脂质体／DNA复合体的摄取机制。通过使用抑制剂 抑制真核细胞跨膜运输的相关路径，再通过阳离子脂质体将绿色荧光蛋白基因、荧光素酶报告基 因转染到细胞中。利用荧光显微镜、微光检测仪定性以及定量检测不同抑制剂浓度下转染效率的 差异，MTT法检测各浓度下的细胞存活率，确定对相应路径的依赖性。结果显示，在细胞存活率保 持在60％vX上的前提下，镜下观察到随着药物浓度的升高，荧光强度明显减弱，微光检测数据显示 随着药物浓度增加，基因表达的效率具有明显的下降趋势。因此推测，Hela细胞主要通过网格蛋白 以及小窝蛋白介导的路径摄取脂质体／DNA复合体，对于微管微丝介导的巨胞饮作用也具有一定的 依赖性 。 关键词 阳离子脂质体；基因转染；抑制剂；摄取机制 阳离子脂质体以其高效性、低毒性、低免疫 液Bright—GloTMLuciferaseAssaySystem (美国Pro— 原性、可生物降解等优点，成为近年来基因转运 中 mega)，抑制剂chlorpromazine(美国Sigma)、wort— 的常用载体…。但关于阳离子脂质体运载质粒DNA mannin(美国Acros)、genistein(美国Acros)、长春 进入细胞的路径尚不明确2【】。本实验应用氯丙嗪 花碱(上海生工生物工程技术服务有限公司)。 (chlorpromazine)t、渥曼青霉素(wortmannin)[、高 1．2 方法 金雀花碱(genistein)t、长春花碱(vinblastine)t】等能 1．2．1 抑制细胞的跨膜运输路径 取对数生长期 够作用于细胞膜表面的化学抑制剂，作用于Hela细 的Hela细胞，用0．25％胰蛋 白酶消化后计数，按每孔 胞，使细胞膜上相应的运输通道受到抑制，在保持 1×10个细胞接种于96孔培养板上，培养16~24h，使细 细胞具有较高存活率的前提下，利用阳离子脂质体 胞密度达到70％～80％。每种抑制剂按不同浓度加入 Lipofectamine2000运载绿色荧光蛋 白基 】和荧光 到培养板中，每组设3个平行样，作用时间为1h。 素酶报告基因[】进行细胞转染，然后定性 以及定量 1．2．2 转染绿色荧光蛋 白基因，定性检测抑制作用 检测 目的基因表达效率的变化，从而得出相应摄取 对转染效率的影响 将Hela细胞接种到透明的96 路径在阳离子脂质体介导的基因转染中的作用。 孔培养板 中，细胞密度达到70％～80％后进行抑制。将 0-3 质粒pGFP-N2~10．9 脂质体Lipofectamine2000 1材料与方法 分别稀释于25 低糖DMEM中，然后将脂质体稀释 1．1材料 液滴加到质粒稀释液中，室温静置20min。移去原先 1．1．1 细胞株以及培养方法 人 宫颈癌细胞株 的培养基，用无血清双抗的IIMI1640清洗一遍并替 Hela细胞(中国科学院上海生物化学与细胞生物学 换后，将脂质体／DNA混合液(50 L)加入到培养板 中。 研究所)，培养于含有10％胎牛血清、青链霉素各为 4h后换含有10％血清和100U／mL双抗的RPMI1640 100U／mL的RPMI1640培养基中，置37。C