HIV自然感染与疫苗诱导产生抗体鉴别肽的原核表达及纯化.pdfVIP

1254 中国生物制品学杂志2Ol1年 11月第24卷第 11期 ChinJBiologicalsNovember2011，Vo1．24No．11 【基础研究 】 HIV 自然感染与疫苗诱导产生抗体鉴别肽的原核表达及纯化 袁作为 张君 胡接力 张秀瑜 黄爱龙 郑建 【摘要 】 目的 原核表达并纯化HIV 自然感染与疫苗诱导产生抗体鉴别肽skl、sk2、sk3及3条肽段串联序列。方法 用 普通 PCR及重叠延伸PCR法从HIV1B亚型质粒扩增得到skl、sk2、sk3基因序列及 3条肽段基因片段的6种连接序列，并分 别克隆人原核表达载体pET一32a(+)及pGEX4T一2中，转化大肠杆菌 BL21(DE3)，IPTG诱导表达 ，表达产物经Ni．NAT或谷胱甘 肽．Sepharose一4B层析柱亲和层析纯化。SDS—PAGE分析融合肽的表达，Westernblot分析融合肽的抗原性。结果 分别以pET一 32a(+)和pGEX4T一2为载体，共构建了l8个重组表达质粒 ；his—skl、his．sk123、his—sk213、his—sk231及 GST．sk3、GST．sk123、GST— sk213分别在pET一32a(+)及pGEX4T．2表达载体中以可溶形式表达，且均能与HIV．1阳性血清反应 ，而不能与HIVDNA．天坛疫 苗免疫血清反应；经大量诱导表达纯化后，GST．sk3表达量最高，可达40mg／L，纯度超过90％。结论 已成功表达并纯化了具 有生物学活性的HIV 自然感染与疫苗诱导产生抗体鉴别肽 ，为研制HIV 自然感染与疫苗诱导产生抗体鉴别诊断试剂盒奠定了 基础。 【关键词】 HIV；自然感染；疫苗；抗体 ；抗原肽；诊断，鉴别 【中国图书分类号】R373．9R392—33 【文献标识码 】A 【文章编号】1004—5503(2011)11-1254—06 ProkaryoticExpressionandPurificationofHIV DifferentialPeptidesforNatu- ralInfection．．elicitedandVaccine．．inducedAntibodies YUANZuo—wei，ZHANGJun，HUJie—li，ZHANGXiu—yu，HUANGAi—long，ZHENGJian (KeyLaboratoryof MolecularBiologyonInfectiousDiseases，MinistryofEducation，ChongqingMedicalUniversity，Chongqing 400016，China) A【bstract】 Objective ToexpressHIVdifferentialpeptidesskl，sk2，sk3andtheirconcatemersfornaturalinfection—elicited andvaccine—inducedantibodies．M ethods ByroutinePCR andoverlapextensionPCR，skl，sk2andsk3genesequencesaswellas sixconcatemersofthem wereamp1ifiedfrom wholeHIV一1B genomeplasmid，andclonedintoprokaryoticexpressionvectorspET32a (+)andpEGX4T．2separately．TheconstructedrecombinantplasmidsweretransofnnedtoE．colBL2l (DE3)andinducedwith IPTG．Theexpressed productwaspurifiedbyNi—NAT orglutathione—Sepharose一4B affinitychromatography．The expressedfusion peptideswereidentifiedbySDS—PAGE andanalyzedforantigenicitybyWestern blot．ResIIIts A totalof18recombinantplasmids wereconstructedbyusingpET一32a (+)andpGEX4T一2asvectors．Thehis-skl，