基因重组大肠杆菌表达HrpNEcc蛋白的发酵条件及诱导条件优化.pdfVIP

中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology，2009，29(10)：44～49 基因重组大肠杆菌表达 HrpNEcc蛋 白的 发酵条件及诱导条件优化 张 姝 王 敏 韩梅琳 马荣才 陈 强 高俊莲 (1四川农业大学资源环境学院微生物学系 雅安 625014 2北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心 北京 100097) 摘要 对已构建好的表达HrpNEcc蛋白的工程茵BL21(DE3)／pET30a(+)hrpNEcc的摇瓶发酵 条件及乳糖诱导进行优化，通过在7L发酵罐中放大发酵实验，以期提高蛋白产量并降低生产成 本。在摇瓶中优化的发酵及诱导条件是：5％ 的接种量，TB培养基，菌体培养至对数生长前期，添 加 3g／L外源诱 导剂乳糖 时，HrpNEcc蛋 白产量可达 417．60mg／L，比不添加乳糖 时提 高 了 36．73％，比用 I G诱导时提 高了 16．85％。7L发酵罐 中发酵，获得菌体湿重达到 57．24g／L (WCW)，可溶性HrpNEcc蛋 白产量 占细胞总蛋白的50．2％，为3．29 L。 关键词 HrpNEcc蛋 白 重组大肠杆菌 发酵及诱导条件优化 中图分类号 Q93—335 Hrp基 因 (hypersensitivereactionandpathogenicity 条件及基因表达的诱导条件进行优化，以确定出适合 gene)是决定病原菌对寄主植物致病性和诱导非寄主植 工程菌生长的摇瓶培养条件及HrpNEce蛋 白表达的诱 物过敏反应的基因。Hrp基 因簇 中的hrpN(hrpZ， ) 导条件，并进行 7L发酵罐发酵试验，旨在为实现 基因编码的胞外分泌蛋 白Harpins是引发非寄主植物 HrpNEcc蛋白低成本、高产量的大规模生产奠定基础。 过敏性反应的主要因子，能广泛诱 导植物对病虫害和 1 材料与方法 逆境胁迫的防卫反应机制，并刺激植物的生长发育系 统，对作物具有显著的增产效果 。自1986年首次报 1．1 材 料 道 hrp基因以来，人们对植物病原细菌hrp基因的分 1．1．I 供试菌株及来源 含 hrpNEcc基 因的工程菌 布、结构、功能等方面进行了广泛的研究。本实验室从 E．coliBL21(DE3)／pET30a(+)hrpNEcc，卡那霉素抗 大白菜软腐病组织中分离鉴定了一株新的胡萝 卜软腐 性，由本实验室构建并保存。 欧文 氏菌 胡 萝 b亚 种 (Erwiniacarotovorasubsp． 1．1．2 培养基 。LB，TB，LB+M9，2×YT+M9，改进 carotovora，Ecc)BC1[21，从中克隆了hrpNEcc基因，构 的SB(酵母提取物 20g，蛋 白胨 32g，NaC15g)培养基。 建了基因工程菌EscherichiacoliBL21(DE3)／pET30a 发酵罐培养基：酵母提取物 80g，蛋白胨48g，KH：PO (+)hrpNEcc，温室实验表 明，由该工程菌表达 的 9．24g，KHPO 50．16g，丙三醇 16ml，泡敌4ml；补料液 HrpNEce蛋白能够有效防治胡萝 卜软腐欧文氏菌胡萝 培养基：酵母提取物 25g，60％甘油800ml，50％氨水 卜亚种 (Erwiniacarotovorasubsp．carotovora)引起的蔬 400ml，1mol／LHC1200ml。 菜花卉的软腐病 。本研究对已构建好的大肠杆菌基 1．1．3 仪器与试剂 考马斯亮蓝 R一250(Amresco)，牛 因工程菌B[21(DE3)／pET30a(+)hrpNEcc摇瓶发酵 血清 白蛋 白(上海生工)、考马斯亮蓝 G一250(BBI)， 收稿 日期：2009-0525 修 回日期 ：2009-07-07 IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)(Amresco)，蛋 白胨 北 京 市科 学 技 术 委 员 会 农 业 科 技 成 果转 化 专 项 (OXOID)，酵母提取物 (yeastextract，简称YE)，其它试 (72)709050