荧光蛋白真核表达载体的构建及其瞬时表达.pdfVIP

中国科技论文在线 荧光蛋白真核表达载体的构建及其瞬时表达 a a，b 孙婷婷 ，高晓莲 a 浙江理工大学 生物工程所，浙江省杭州市 （310018 ） b 休斯顿大学 生物学与生物化学研究所，美国 TX77004-5001 E-mail ：suntingting1218@126.com 摘 要：荧光蛋白易于和其他蛋白融合，且融合后的荧光蛋白仍能保持荧光激发活性的优点 广泛地应用于细胞学，医学和分子学领域。然而，随着荧光蛋白研究方法的发展对荧光蛋白 的种类也提出了更多的要求。而传统的获得荧光蛋白的方式主要局限于从生物体内直接提取 或通过定点诱变和突变的技术获得，而对利用基因合成的方法合成新型荧光蛋白的研究则很 少。 本文基于微流体芯片合成获得新型荧光蛋白的基础上，构建真核质粒载体 pcDNA3.1(+)-G2-hexaHis ，通过转染进入HeLa 细胞内进行表达，结果显示G2 在真核细胞 中可以大量表达，且荧光强度很强，亚细胞定位结果显示荧光蛋白G2 绝大部分存在于细胞 质中，极少部分分布在细胞核中，故荧光蛋白G2 将成为真核细胞质中蛋白的定位，细胞骨 架标记和细胞分裂，胞质蛋白表达强度等同时也可以应用于细胞核中特异蛋白的标记及核质 间物质运输应用中很有潜力的工具。 关键词：真核载体构建；转染；亚细胞定位 荧光蛋白被证实是活体生物成像的良好工具，被广泛的应用于生物学的不同领域。例如 细胞骨架和细胞分裂，细胞器动力学和囊泡运输，细胞核和细胞质之间的物质运输，蛋白质 之间的互作，蛋白质定位，基因转录强度等的测定[1-4]。近几十年来，绿色荧光蛋白通过和 其他蛋白融合标记不同蛋白的在亚细胞中的分布及动力学或标记细胞中的不同分区和器官 [5,6]。而且随着荧光蛋白变体类型和数量的扩充，其荧光蛋白涉及的新的应用技术也不断展 现，如荧光共振能量转移 （FRET ）、荧光双分子和多分子标记技术、双分子荧光互补技术、 荧光双杂交技术 [7-10] （F2H ）等 。 传统获得荧光蛋白变体的方法局限于通过从生物体直接提取或利用定点诱变和突变的 方法获得，此方法不仅费时耗资金，且不能高通量获得目的荧光蛋白变体。而生物合成方法 解决了这一难题，利用生物合成方法可以合成一些自然界不存在或常规方法难以获得的生物 大分子，而微流体芯片合成技术在生物合成法的基础上得到了增进，其是一种简便、快捷、 准确率高的生物合成技术[11,12] 。本实验基于此技术合成的新型荧光蛋白（此结果将在英文期 刊进行发表），构建真核载体，在Hela 细胞中进行表达，结果显示新型荧光蛋白在HeLa 细 胞可以得到大量表达，故其将成为生物学领域重要的工具。 1 材料和方法 1.1 质粒、感受态、细胞系 载体pcDNA3.1(+)-G2-Hexa His 由本实验室构建；E.coli BL21 感受态本实验室利用0.1 M CaCl2 制备；HeLa 细胞由本校新元医药研究所保存；G2 本实验组微流体芯片从头合成荧光 -1- 中国科技论文在线 蛋白。 1.2 主要试剂 ® Deep VentR DNA 聚合酶 （2 unit/μl，NEB ），dNTP mixture （2.5 mM ，TaKaRa ），dATP （100 mM，Songon），T4 DNA 连接酶(40 U/μl ，NEB) ， BamH Ⅰ（10 U/μl ，Fermentas ）， Xho I (10 U/μl ，Fermentas) ，Xba I （10 U/μl ，Fermentas ）；pcDNA3.1(+)载体系统（Promega ）， TM ® AxyPrep Gel Extraction Ki