Hepc20在毕赤酵母中胞内表达及鉴定.pdfVIP

第 ３７卷 第２期 北京化工大学学报（自然科学版） Ｖｏｌ．３７，Ｎｏ．２ ２０１０年 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ） ２０１０ Ｈｅｐｃ２０在毕赤酵母中的胞内表达及鉴定  ＦａｒｚａｎａＲＡＳＨＩＤ　袁其朋 　孙新晓　李　飞 （北京化工大学 生命科学与技术学院，北京　１０００２９） 摘　要：构建了Ｈｅｐｃ２０的毕赤酵母表达载体，在毕赤酵母中能成功表达有活性的Ｈｅｐｃ２０。优化了菌株的培养诱 导条件，结果表明ＢＭＭＹ培养基是 Ｈｅｐｃ２０表达和重组菌株生长的最佳培养基，甲醇诱导终体积分数０５％，在此 条件下 Ｈｅｐｃ２０在重组菌株中的表达量约为３６ｍｇ／Ｌ。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测显示的２２０００处的条带为重组 Ｈｅｐｃ２０条 带；ＥＬＩＳＡ验证表明重组 Ｈｅｐｃ２０可以跟抗体特异结合，琼脂扩散法抗菌实验表明重组 Ｈｅｐｃ２０对金黄色葡萄球菌 和枯草芽孢杆菌表现出抗菌活性。 关键词：抗菌肽；Ｈｅｐｃ２０；铁；毕赤酵母 中图分类号：Ｑ７８６ 母 ＧＳ１１５菌株以及质粒 ｐＰＩＣ３５Ｋ购 自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 引　言 公司。 ｈｅｐｃｉｄｉｎ是在肝脏中合成的富含半胱氨酸的阳 １２　试剂及培养基 离子多肽，最早由Ｋｒａｕｓｅ从血液中分离得到，在体 Ｔ４ＤＮＡ连接酶、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、ＤＮＡ聚合酶、质 外表现出良好的抗菌活性［１］。近年来的研究发现 粒提取试剂盒，Ｏｍｅｇａ公司；兔抗人抗体 ＨＥＰＣ１２Ｓ、 ｈｅｐｃｉｄｉｎ对肠 内铁离子的吸收起关键 的调节作 人 Ｈｅｐｃ２０、ＨＥＰＣ７１Ｐ，美国 ＡｌｐｈａＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ公 用［１－２］，通过与铁的膜转运蛋白相互作用，减少肠内 司；羊抗兔二抗（连接 ＡＰ），Ｓｉｇｍａ公司。 ［３］ ＬＢ培养基、ＹＰＤ培养基、ＭＤ培养基、ＭＭ培养 铁的吸收并抑制巨噬细胞内铁的释放 。Ｚｈａｎｇ ［４］ 基、ＢＭＭ培养基、ＢＭＧＹ培养基、ＢＭＭＹ培养基、 等 提出ｈｅｐｃｉｄｉｎ在医学上可以用于多种铁稳态失 衡的治疗。 ＲＤＢ培养基的配制均按照 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司毕赤酵母 最初从尿液中分离得到的 ｈｅｐｃｉｄｉｎ浓度很 操作手册进行。 低［５］，利用基因工程手段进行异源表达有望实现 １３　重组菌株的构建 ｈｅｐｃｉｄｉｎ的大量生产。在毕赤酵母菌株 Ｘ３３中表达 １３１　ｐＰＩＣ３５ＫＨ表达质粒载体的构建 ［６］已有报道。Ｈｅｐｃ２０（比 Ｈｅｐｃ 按照毕赤酵母密码子的偏好性，合成了一段包 加标签的 Ｈｅｐｃ２５ ２５缺少 Ｎ端５个氨基酸）具有更强的抗菌活性，其 含肠激酶识别位点的９９ｂｐ的Ｈｅｐｃ２０序列，将其插 在真核细胞中的表达和纯化还未见报道。本文首次 入 ｐＭＤ１８Ｔ上游 ＥｃｏＲＩ，下游 ＮｏｔＩ位点。质粒经 在毕赤酵母中胞内表达 Ｈｅｐｃ２０，并对表达产物进 ＰＣＲ以及 ＤＮＡ测序验证。Ｈｅｐｃ２０片段用带有 行了活性分析。 ＥｃｏＲＩ位点的上游引物（Ｆ：５′ＡＴＧＡＡＴＴＣＧＡＣＧＡＴ ＧＡＣＧＡＴＡＡＧＡ３′）和带有ＮｏｔＩ位点的下游引物（Ｒ： １　材料和方法