猪呼肠孤病毒感染实验室诊断技术.pdfVIP

畜牧与饲料科学 AnimalHusbandryandFeedScience 2010， 31(5)：178 猪呼肠孤病毒感染实验室诊断技术 剥、运华 (安徽省砀 山县畜牧兽医水产局 ，安徽 砀 山 235300) 摘要：猪呼肠孤病毒属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属。已报道的猪呼肠孤病毒共3个血清型。该病毒所致的临床症状 和病理变化都不具有特征性 ，因此 ，该病的诊断有赖于病原或抗体的检测。对猪呼肠孤病毒感染的实验室诊断技术进 行 了阐述，以期为有效防控该病提供参考。 关键词 ：猪呼肠孤病毒 ：实验室诊断 中图分类号 ：$858．285．3 文献标识码 ：A 文章顺序编号 ：1672—5190(2010)05—0178—01 1 病料的采集和处理 疑问，可做传代培养。样品分离病毒时 ，设阳性对照 ，将标准 1．1 病料的采集 从多种病料中均可分离到猪 呼肠孤病 参考毒株培养于MA。04细胞 ，观察细胞病变 ，被检样品 CPE 毒 ，但最好是采集发病初期 (8～12h)的粪便或呼吸道分泌 与标准参考毒株 CPE一样．则可确认由被检样品分离到了 物。将采集到的病料冷冻保存 ，尽快进行检验。 猪呼肠孤病毒。另外，还应将培养物经 Giemsa染色后用光 1．2 病料的处理 将采集到的粪便或分泌物制成 1：10悬 学显微镜观察细胞浆内嗜酸性包涵体 ．或用电镜观察细胞 液 ，反复冻融 2次 ，3000rm／in离心 30min，取上清液 ，上清 内、外 的病毒形态 ，也可做 HA及 HI检查 。 液经直径为0．22 m的微孔滤膜滤过后供接种用 。 3 镜检 2 病毒的分离培养 从病猪粪样 、呼吸道分泌物 、肺 、脾等组织均可检出该 一 般应用细胞培养分离技术进行该病毒的分离。最常 病毒 ，但以发病后8～12h内的粪和呼吸道分泌物检出率最 用的细胞是 MA 细胞系，该病毒对多种细胞系 (如KB和 高，特别是粪便为首选样品。 Hela细胞系等 )以及多种原代细胞都能适应 ，但初次分 离 3．1 病料处理病料 病料用蒸馏水做 1：5或 1：10稀释 (细 时 ，选用 MA 细胞系效果较好 。细胞浓度为2x10s个 ／mL， 胞培养物不必稀释)，冻融 3次 。3000r／min离心 30min，取 培养液为含 10％牛血清的MEM，接种 1mL的MA04细胞 于 上清液待用 。 细胞培养管 内，细胞长成单层后供试验接种用。所用哺乳动 3．2 负染色镜检 铜网上滴加 1滴检样上清液 ，1—2min 物的血清均可能含有抗呼肠孤病毒的1个或几个血清型的 后 ，用吸水纸除去水滴 ．干燥 ．网上滴加 1滴 2％～3％磷钨酸 抗体 。为了防止血清抗体干扰试验结果 ，细胞单层要用 钠染色液 ，0．5～1min后吸掉染色液，干燥后可立即用电子显 Hanks液洗涤 3次，除去残余血清 。维持液用 199液或 微镜观察或短时间内保存待检。 Eagle氏液 ，其中含有 100IU青霉素、100txg／mL链霉素。 猪呼肠孤病毒具有特征性 的20面体对称双层衣壳结 2．1 接种 待细胞长成单层后 ，吸出培养液 ，充分洗涤3 构。病毒粒子的核心由核酸基因组及其紧密连接 的内衣壳 次。每份样品接种 2～4管，每管接种样 品0．1mL．感作 1h， 构成 ，其外还有一层外衣壳 ，无囊膜。完整的病毒粒子直径 用 Hanks液洗2次 ，加维持液 1mL，置 37℃内静止培养 ， 为 76am左右 ，核心的直径约 52nm。电子显微镜下很容易 转鼓培养 (10～15r／min)可促进细胞病变。每隔3d用光学显 看到病毒粒子表面 的壳粒 ，外衣壳共有92个壳粒 ，分别由 微镜观察 1次 。至 12d时 ，从每管取上层液 0．1mL移种于 五邻体和六邻体组成 ，其中80个为六邻体