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- 2017-09-13 发布于安徽
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2．2．5半体内pull．down实验……………………………………………………………………23
2．2．6免疫共沉淀实验(Co．IP)………………………………………………………………．24
2．2．7免疫印迹分析蛋白表达…………………………………………………………………．．24
2．2．8酵母双杂交实验…………………………………………………………………………．25
2．2．9基冈表达谱分析…………………………………………………………………………．25
2．2．10放射自显影实验检测BKll的底物磷酸化…………………………：…………………．26
2．2．12点突变载体的构建………………………………………………………………………27
2．2．13质谱分析BKI1磷酸化位点………………………………………………………………27
2．2．14细胞质和细胞核组分分离实验…………………………………………………………28
2．2．15细胞膜和细胞质组分分离实验…………………………………………………………．28
2．2．16质谱分析BKll互作蛋白………………………………………………………………．．28
2．2．17农杆菌介导的拟南芥的转化……………………………………………………………29
2．2．18植物材料的种植…………………………………………………………………………29
2．2．19植物材料的激素处理……………………………………………………………………29
2．2．20
BKII体内磷酸化的检测…………………………………………………………………30
2．2．21烟草叶片细胞瞬时转化实验……………………………………………………………30
第三章BKll从细胞膜解离的机制研究…………………………………………………………31
3．1BKll的氮末端和碳末端的功能………………………………………………………………3l
3．1．1
BKll的N末端负责BKll的膜定位……………………………………………………．3l
3．1．2
BKII的C末端负责BKll的调控功能…………………………………………………．32
3．1．3细胞质定位的BKll．C促进了BR信号的输出…………………………………………38
3．2
3．2．1
BKll在植物体内被磷酸化………………………………………………………………．．39
3．2．2
3．2．3细胞膜定位的BKII抑制BR信号的输出………………………………………………44
3．2．4
3．3讨论……………………………………………………………………………………………………………………………47
第四章14-3—3蛋白与磷酸化的BKll互作的机制研究 49
4．1磷酸化的BKII和14．3．3蛋白相互作用……………………………………………………。49
4．1．1
BKII和14．3．3蛋白的相互作用…………………………………………………………49
4．1．2
eBL处理促进BKll与14．3．3蛋白的相互作用…………………………………………52
4．1．3BKI
1的$270／274位点介导了BKII与14．3．3lc的相互作用……………………………53
4．1．4$270和$274突变为天冬氨酸不能够模拟BKll的磷酸化……………………………．55
4．2过表达14．3-3K促进BKll从细胞膜上的解离………………………………………………56
4．2．1
eBL处理促进14．3．3K与磷酸化BESl的解离…………………………………………．．56
4．2．214-3．3K的基因表达模式与BKll相似…………………………………………………．．57
4．2．314．3．3lc负调控BR信号的输出……………………………………………………………58
4．2．4过量表达14-3-31c可以释放过表达BKII对植株生长的抑制作用……………………．58
4．2．5 14．3．3蛋白帮助磷酸化的BKII从细胞膜解离到细胞质中……………………………60
4．3讨论……………………………………………………………………………………………………………………．
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