荧光定量PCR检测家蚕核型多角体病毒的研究初探.pdfVIP

技术 ·食品工程 c 一 薯 。。 荧光定量PCR检测家蚕核型多角体病毒的研究初探 冯爱钧 张桢琦 鲍大权 (1．宁夏吴凯生物科技有限公司 2．江苏牧羊迈安德食 品机械有限公司) 摘【要】本文选用家蚕核型多角体病毒的单拷贝基因DNA聚合酶作为检测靶标，构建含有 DNA聚合酶基 因片段 的质粒载体 ，作为标准品，试图运用荧光定量PCR技术对该病毒进行定 量检测，以便于以后深入对病毒 感染机制进行研究。试验结果初步证实，所构建的重组质粒可 作为标准品用于荧光定量PCR试验，实时检测病毒在宿主中的数量。 【关键词】家蚕核型多角体病毒BmNPV；DNA聚合酶基因；荧光定量PCR 中图分类号：TS201．3 文献标识码：A 文章编号：1673—7199(2010)11—0172—05 家蚕 核型多角体痫 (血液 型脓病 )是蚕 茧生产 中 光定量 PCR分析显示 DNA聚合酶基因片段在重组质粒 经常发生的一种危害性极强的传染性蚕病 ，自20世纪 中能得到较好的扩增，而且熔解曲线峰图单一，扩增 80年代以来，家蚕核型多角体病 已经成为世界主要养 片段特异。结果初步表 明，构建的重组质粒可作为标 蚕地区危害最严重的疾病 ，是蚕茧产量歉收的重要原 准品应用于今后的病毒定量分析中。 因之一 。家蚕核型多角体病是一种亚急性病 ，发病期 本试验的主要内容：①BmNPV病毒DNA的提取 ； 为 5～6d。20世纪中，人们主要应用生理学 、病理学 、 ②设计DNApol基因的扩增引物；③扩增DNApol基因； 遗传学 、生态学等方面的研究成果 ，通过采取彻底消 ④ 将 DNApol基因构建到 PMD—l8T载体 中；⑤ 毒 、消灭传染源 、加强饲养管理、提高蚕体对病毒的 DNApol—PMD18一T质粒标准品的制备；⑥制备永久菌， 抵抗性 以及饲养抗病性品种等方面的措施 ，对家蚕核 保存克隆载体，为荧光定量 PCR做准备；⑦荧光定量 型多角体病进行防治，取得 了明显的效果 。但是 由于 PCR检测重组质粒 中病毒基因片段。 病毒侵染过程 的分子机制还没有 了解清楚 ，目前还没 1 材料与方法 有有效的治疗措施 。 目前有不少 的研究者正尝试用各 种分子生物学 的技术如RNAi介导的基 因沉默抑制病毒 1．1 材料 复制或宿主受体基因的表达来控制 BmNPV病 。因此 ， 1．1．1 家蚕及病毒材料 无论是了解BmNPV与其宿主之间的相互作用机制，还 家蚕品系大造 由西南大学家蚕种质资源库提供 。 是杆状病毒生物杀虫剂的改造，或者提高重组杆状病 幼虫在西南大学农业部蚕学重点试验室按常规桑叶育 毒表达载体在昆虫个体 内的表达效果 ，都 需要 了解和 法饲养，感染BmNPV病毒后，待其发育至5龄第6天 掌握病毒在其天然宿主 (家蚕)中的真实和准确的含 取其血液用于病毒DNA的提取。 量 。 1．1_2 主要试剂 通过荧光定量 PCR技术对宿主中病毒 的检测是近 1．1_2_1 病毒DNA提取 年来发展起来的高效检测方法。此检测手段的一个前 DNA提取缓 冲液 ：试剂盒 MiniBESTViralRNA／ 提便是需要制备病毒定量的标准品。本试验主要从病 DNAExtractionKitVer．3．0购 自TAKARA 公司 ；DNA 毒DNA的提取开始 ，设计引物 ，最终构建 了含有 Bm— 回收试剂 ：试剂盒购 自华舜公司。 NPV病毒 DNA聚合酶基 因片段的重组质粒 。初步 的荧 1．1_2_2 基 因扩