的影响张浩然曾志勇陈君敏(福建医科大学附属研究探讨应用RNA干扰技术构建人DEPTOR基因的shRNA慢病毒载体,鉴定在多发性骨髓瘤RPMI8226细胞.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（５）：１３２１ 体外ＲＮＡ干扰下调ＤＥＰＴＯＲ表达对人多发性 骨髓瘤细胞增殖和凋亡能力的影响  张浩然　曾志勇 　陈君敏 （福建医科大学附属第一医院　福州　３５０００５） 摘要　目的：研究探讨应用ＲＮＡ干扰技术构建人 ＤＥＰＴＯＲ基因的ｓｈＲＮＡ慢病毒载体，鉴定在多 发性骨髓瘤ＲＰＭＩ８２２６细胞上的沉默效果，并评价ＤＥＰＴＯＲ对人多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡 能力的影响。方法：设计４个ＤＥＰＴＯＲｓｉＲＮＡ序列，化学合成后退火形成双链，克隆到酶切的 ｈＵ６ＭＣＳＣＭＶＥＧＦＰ（ＧＶ１１５）ｓｈＲＮＡ慢病毒载体。重组质粒经ＰＣＲ测序鉴定后，脂质体介导下 转染２９３Ｔ细胞，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＤＥＰＴＯＲ的表达，筛选出干扰效果最佳的ＧＶ１１５ｓｈＲＮＡ。将筛 选的ＧＶ１１５ｓｈＲＮＡ与慢病毒包装质粒共转染２９３Ｔ细胞生成病毒，收集病毒上清并浓缩，测定浓 度。将病毒颗粒感染多发性骨髓瘤 ＲＰＭＩ８２２６细胞，应用ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ方法从 ｍＲＮＡ水平及 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法从蛋白水平检测ＤＥＰＴＯＲ的沉默效果。运用四甲基偶氮唑蓝（ＭＴＴ）法检测骨髓 瘤细胞增殖能力的变化；流式细胞仪检测细胞凋亡；用 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析 ｃｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ３和 ｃｌｅａｖｅｄＰＡＲＰ的变化。结果：构建的慢病毒载体ｓｈＲＮＡ的ＰＣＲ鉴定和测序正确，成功筛选出最有 ９ 效抑制 ＤＥＰＴＯＲ表达的ｓｈＲＮＡ２序列，包装病毒后滴度达到 １×１０ＴＵ／ｍｌ。慢病毒感染ＲＰＭＩ ８２２６细胞后可表达 ＥＧＦＰ，ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ和 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测 ＤＥＰＴＯＲ的表达明显下降。下调 ＤＥＰＴＯＲ基因可显著减慢骨髓瘤细胞的生长速度（Ｐ＜０．０５），肿瘤细胞的凋亡率上升（Ｐ＜０．０１）。 ＤＥＰＴＯＲｓｈＲＮＡ上调ｃｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ３、ｃｌｅａｖｅｄＰＡＲＰ和Ｂａｘ表达，下调Ｂｃｌ２及ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通 路的表达（Ｐ＜０．０１）。结论：成功构建了ＤＥＰＴＯＲｓｈＲＮＡ重组慢病毒载体，其转染多发性骨髓瘤 ＲＰＭＩ８２２６细胞后显著抑制了ＤＥＰＴＯＲ的表达。ＤＥＰＴＯＲｓｈＲＮＡ可以有效地诱导骨髓瘤细胞的 凋亡，并抑制肿瘤细胞的增殖。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路可能参与了其凋亡过程。 关键词　ＤＥＰＴＯＲ　多发性骨髓瘤　ＲＮＡ干扰　增殖　凋亡 中图分类号　Ｑ８１３ 　　ＤＥＰＴＯＲ是新的雷帕霉素靶蛋白（ｍＴＯＲ）结合分 以结合ｍＴＯＲｃｏｍｐｌｅｘ１（ｍＴＯＲＣ１）也可以结合 ｍＴＯＲ 子，因其含有２个ＤＥＰ（ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ，ｅｇｌ１０，ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ）序 ｃｏｍｐｌｅｘ２（ｍＴＯＲＣ２），ＤＥＰＴＯＲ缺失能同时激活 列区而得名。ＤＥＰＴＯＲ是 ｍＴＯＲ的特异性抑制蛋白， ｍＴＯＲＣ１信号通路和抑制 ｍＴＯＲＣ２信号通路，从而调 ［１］ 而ｍＴＯＲ是一种调节细胞生长和增殖的关键蛋白激 控它们在细胞生长、增殖和生存方面的功能 。 ［１２］ 　　更值得一提的是，不同于其他类型的肿瘤，研究发 酶 。同时ｍＴＯＲ通路作为细胞能量和代谢的中心 ［３］ 现ＤＥＰＴＯＲ高表达于大部分多发性骨髓瘤（ＭＭ）细胞 控制元件，在正常细胞中同样起重要功能 。ＤＥＰＴＯＲ ［４］ 同时包含一个ＰＤＺ序列区，通过该序列 ＤＥＰＴＯＲ既可 系 。高表达ＤＥＰＴＯＲ可以活化磷脂酰肌醇三磷酸激