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2013年10月 基础医学与l临床 October2013
第33卷第10期 Basic＆ClinicalMedicine V01．33No．10
326-02
文章编号：1001-6325(2013)10一l
大鼠脊髓微血管内皮细胞的分离培养与鉴定
苑晓晨，李炳蔚，秦伟伟，武清斌，荆瀛黎，李宏伟，刘淑英，修瑞娟+
(中国医学科学院北京协和医学院微循环研究所，北京100005)
中图分类号：R543；R一332文献标志码：A
cordmicrovascularendothe— min。去f：清重悬后用
脊髓微血管内皮细胞(spinal 次，1 000×g离心8min；700×g离心5
lial cell mm培养皿。加入含嘌呤霉素的内
cells，scMEcs)参与构成血脊髓屏障，其功能变化与多种strainer过滤，种于35
皮细胞培养基(4 h后去除嘌呤霉素，此后每
脊髓相关疾病相关。目前分离ScMEcs的文献很少。本研 mg／L)培养。48
究拟基于分离多种原代内皮细胞的经验¨‘21，建立分离纯化 2天换液一次。
SCMECs的方法。 1．2．3倒置罹微镜观察scMEcs形态：应用倒置湿微镜每
1材料与方法 隔24h观察内皮细胞从微血管片段的爬出及生长状况并扣
1．1 材料 照。
1．2．4免疫细胞化学方法鉴定scMEcs：待细胞生长亍f：合至
1．1．1试剂：DMEM(高糖)、胎牛血清(FBs)、Ⅱ型胶原蛋白
酶、双抗、庆大霉素、谷氨酰胺和l×PBS(北京协和医学院细80％左右，对细胞进行固定和透化处理，抗体孵育后置于荧
semm 光显微镜下观察。
胞中心)；牛血清白蛋白(bovinealbumin，BSA)、胶原
1．2．5细胞增殖曲线测定：用Mrrr法检测：细胞消化后种于
蛋白酶／分散酶(coJlagenase／dispase)(Roche公司)；嘌呤霉
ceu公司)；96孔板，每组6个复孑L，实验重复3次。
素(sigrna公司)；内皮细胞培养基(EcM)(scien
willebrand 2结果
兔抗大鼠von factor(vwF)抗体(santacmz公司)；
2．1 scMEcs的形态学鉴定：微血管片段旱典型的串珠状或
抗GFAP抗体和抗d—sMA抗体(Abcam公司)；FITc标记和
TRITC标记的二抗(北京中衫金桥公司)。 分支状(图1A)；48h后scMEcs从微血管片段中爬出(图
1B)。细胞呈梭形单层贴壁生长；第4天细胞逐渐增多，呈现
1．1．2试剂的配制：用DMEM配制终浓度为1∥L的Ⅱ型胶
典型的“鹅卵石”状(图lc)；第6天细胞汇合紧密，呈现“漩
原蛋白酶和collagenase／djspase；配制含20％BSA的DMEM
涡状”(图1D)。
溶液，即20％BSA—DMEM；1％纤连蛋白、0．2％Tritonx-100、
0．5％BsA封闭液用1×PBs配制。
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