醛固酮与转化生长因子-β1在心肌纤维化中的作用机制.pdfVIP

实用临床 医学2012年第 l3卷第 l0期 PracticalClinicalMedciine，2012，Vol13，No10 · 5 · 信号蛋白，调节多种靶基因的表达 。在细胞增殖、分 一 2O℃保存 。；SB431542预处理组 ：RT—PCR检测 化及细胞外基质合成中发挥重要作用。Smads蛋白 Smad2、I型胶原、Ⅲ型胶原表达时增加 TGF一311受 是 目前所知主要的TGF—B1受体胞内激活底物，介 体拮抗剂(SB431542)+醛固酮。 导TGF一311信号的胞 内转导。当TGF一311通路被激 1．2．3 培养液 中TGF一311水平的测定 活，受体激活型Smads与抑制型Smads之间的平衡 应用 ELISA法检测各组TGF一131水平 ，按试剂 被打破 ，就会导致心肌纤维化的发生_2_3]。 盒说明书步骤进行，酶联免疫检测仪测 450nm波 长 OD值 。根据标准曲线，计算 TGF一311浓度。 本研究 旨在通过探讨醛 固酮致心肌纤维化 的 1．2．4 RT—PCR检测 Smad2、I型胶原、Ⅲ型胶原的 过程中对 TGF～311／Smads信号通路的调节及对下游 表达 因子的影响．进一步阐明醛固酮致心肌纤维化的机 取 1×10个细胞 ．加入 1mLRNAiso。充分混 制 ，从而为心肌纤维化的干预研究提供理论基础和 匀，吹打数次。采用氯仿异丙醇法抽提细胞~,RNA。 作用靶点。 按照 PlusSYBR⑩PrimeScript⑧RT—PCRKit试剂 1 材料与方法 说明书，反转录合成 cDNA。Smad2上游引物 ：5一 ATGTCGTCCATCITI’GCCATT一3，下游引物 ：5-GT— 1．1 动物和试剂 CCCCAAA1]T[I’CAGAGCAA一3；I型胶原上游引物 ： 出生 3d内的SD大鼠。雌雄不限，购于南 昌大 5-ACATGTICAGC，nT[I1GTGGACC一3，下游 引物 ：5 学动物中心 ；醛固酮、依普利酮购于 Sigma公司； 一 TAGGCCATFGTGTATGCAGC一3：m型胶原上游引 DMEM培养基 、胰蛋 白酶购于美 国Gibco公司；胎 物 ：5一TGGTAGAAAGGACACAGAGGC一3 ，下游 引 牛血清购于奥地利PAA公司；波形蛋 白单克隆抗 物 ：5一TCCAACTYCACCCTYAGCACC一3；B—actin上 游引物 5’一GCATCCCCCAAAGTTCACAA一3’：下游 体、纤维连接蛋 白单克隆抗体、平滑肌肌动蛋 白单 引物 5’一AGGACTGGGCCATYCTCCTr一3’。依照说 克隆抗体为美国SantaCruz公司产品：SABC试剂盒 明书操作 。采用 ABI7500FastReal—TimePCRSys— 为武汉博士德公司产品：TGF一311酶联免疫试剂盒 tern，反应条件如下 ：SYBRPremixExTaqTMII10 购 自Genzyme公司；PlusSYBR⑧PrimeScript⑧RT—