唐鱼热休克蛋白60基因cDNA克隆及表达.pdfVIP

第 3O卷 第 5期 华 中 农 业 大 学 学 报 Vo1．3O No．5 2011年 1O月 JournalofHuazhongAgriculturalUniversity Oct．2011，635~ 639 唐鱼热休克蛋 白60基因cDNA克隆及表达 刘海超 陈辉辉 覃剑晖 马徐发 华中农业大学水产学院／农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉 430070 摘要 采用 RT-PCR和RACE技术 ，成功克隆了唐鱼(Tanichthysalbonubes)热休克蛋白60基因cDNA全 长序列，命名为TallSP60(GenBank登录号：HM234132)。研究表明：该基因序列全长为2486bp，5端非翻译区 (URT)102bp，31URT656bp，开放阅读框 (ORF)1728bp，编码 575个氨基酸。序列比对分析表明唐鱼 HSP60 与斑马鱼 (Daniorerio)的相似性高达96．2 ，与鲫 (Carassiusauratus)、褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)、大西洋 鲑 (Salmosalar)以及非洲爪蟾 (Xenopustropicalis)的相似性分别为 93．2 、89．7 、88．3 和 83．8 。 ClustalXkL对结果表明：该序列含有典型的mt-HSP60特征序列、ATP结合位点，以及 C末端保守的重复区域 GGM。进化分析结果表明，唐鱼HSP60与斑马鱼 HSP60聚为一支，二者亲缘关系较近。荧光定量PCR显示唐 鱼 HSP60的mRNA在肝脏、肌肉、鳃、鳍条、眼睛、卵巢、肠道和脑等8种组织中均有表达，其中肝脏中表达量最 高，而在鳃和鳍条呈微量表达。统计分析表明，其他各组织与肝脏相 比均有显著差异。铜暴露后 ，唐鱼肝脏 HSP70mRNA表达水平分别在 48h和96h出现上调，均显著高于对照组。 关键词 唐鱼(Tanichthysalbonubes)；热休克蛋白60(HSP60)；克隆；表达；荧光定量PCR 中图分类号 Q781 文献标识码 A 文章编号 1000—2421(2O11)O5一O635一O5 热休克蛋 白(heatshockprotein，HSPs)又称应 析该基因的表达模式，旨在从分子生物学角度建立 激蛋 白，是生物体在受应激原刺激后，发生热休克反 环境污染物的一个检测系统或一种方法，为探讨水 应时所产生的一类蛋白，该蛋 白具有高度的保守性， 环境中污染物对唐鱼的影响机制奠定基础。 普遍存在于从细菌到人的整个生物界[1]。根据其相 1 材料与方法 对分子质量可分为热激蛋 白90(HSP90)、热激蛋白 70(HSP70)、热激蛋白60(HSP60)和小热激蛋 白等 1．1 供试鱼 本试验所用唐鱼 (T．albonubes)由中国水产科 家族[2]。HSP60作为一种分子伴侣，能协助变性和 学研究院珠江水产研究所提供。 不可溶的凝聚蛋白重新恢复天然构象，其重要的生 1．2 总RNA的提取 物功能已日益引起人们的重视 。唐鱼 (Tanichthys 采用 TRIzol(Invitrogen)法提取总 RNA。取 albonubesLin)又名 白云金丝鱼，隶属鲤形 目、鲤科、 体长(2．85±0．17)am、体质量(0．59±0．18)g、 唐鱼属。目前我国仅在广东从化等少数地点发现 自 鲜活健康的唐鱼，以高锰酸钾对其消毒，再用 75 然生活的群体[3]。作为国家二级保护动物，唐鱼以 的乙醇棉球擦洗 ，置于无菌托盘